[发明专利]类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法

权利要求书

1.类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：准备试验动物及其组织

选取24只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为2个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，CIA模型组(n＝12)：多点皮下注射牛II型胶原；

S2：总RNA的提取

依据RNAiso Plus实验操作说明提取CIA大鼠关节总RNA；

S3：总RNA浓度的测定

NanoDrop ND-2000检测总RNA纯度、浓度

S4：cDNA合成

按照SYBR PrimeScript^TM RT Reagent Kit试剂盒操作说明进行，对总RNA反转录；

S5：引物设计与合成

参照已登录大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κB cDNA序列，利用Primer Premier 5.0软件结合NCBI Blast在线引物设计，合成5对特异性引物；

S6：凝胶电泳检测

以CIA大鼠cDNA为模板，使用15μL体系PCR检测；

S7：回收和纯化PCR产物

在凝胶成像系统中，隔离板将紫外线隔开，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF-κBcDNA片段的凝胶，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；

S8：目的片段与载体连接

按照pMD18-T试剂盒使用说明将回收出来的DNA片段连接至T-Vector；

S9：转化

S10：蓝白斑筛选及测序

第2d转化的平板中，一部分长有蓝斑，一部分长有白斑，挑取白色单菌落，放入含AMP的LB液体培养基中，37℃ 150r/min恒温摇荡，当白色云雾时将其取出，4℃保存，菌液交由公司进行序列测定。

2.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，其特征在于，S1的所有Wistar大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水，试验时间为28d，所有试验Wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d，饲喂结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集2个不同试验组Wistar雌性大鼠关节的相同部位，放入DEPC水处理过的离心管，迅速置于液氮中保存。

3.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，其特征在于，S2的操作步骤如下：

S2-1：在试验开始前，高温高压条件下，将试验所需的所有玻璃器皿灭菌，用0.1％DEPC水将提取RNA所需的所有EP管、枪头等浸泡12-18h，121℃高压灭菌15min，60℃真空烘干备用；

S2-2：从-80℃冰箱中取出样品后迅速称量，使用液氮预冷的研钵研磨组织；

S2-3：在研磨好的组织中加入1000μL RNAiso Plus，20℃放置5-10min；4℃ 12,000r/min(或13,000g)高速离心5min，取上清于新的1.5mL EP管中；

S2-4：上清中加入200μL氯仿，振荡混匀，20℃放置5-10min；4℃12,000r/min(或13,000g)高速离心15min；

S2-5：液体分3层，上层是核酸，第2层是蛋白，第3层是氯仿，吸取上层液相于新EP中，加入200μL异丙醇，常温静置10min，4℃ 12,000r/min离心10min；将上清液倒掉，底部白色沉底即为总RNA；

S2-6：向沉淀中加入1mL75％乙醇，白色沉淀悬浮，4℃ 12,000r/min离心5min，倒掉上清液，超净工作台中干燥5-10min，加入30-50μL RNase-free H₂O，溶解RNA，测定RNA OD值和浓度，-80℃保存。

4.根据权利要求1所述的类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，其特征在于，S4的反应条件：37℃ 15min，85℃ 5sec，测定反转录产物进行浓度，符合试验要求后，-20℃保存。