[发明专利]体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用。在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：S01、构建第一重组质粒，第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将第一重组质粒载体进行过表达，得到第一融合蛋白；第一融合蛋白中含第一检测蛋白和萤光素酶蛋白片段；S02、构建第二重组质粒，第二重组质粒中含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；将第二重组质粒载体进行过表达，得到第二融合蛋白；第二融合蛋白中含第二检测蛋白和萤光素酶互补蛋白片段；S03、将第一融合蛋白和第二融合蛋白在细胞外孵育，加入萤光素酶底物，观察是否发射萤光，并检测发光强度。

技术领域

本发明属于活性药物筛选技术领域，具体涉及体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用。

背景技术

随着生命科学研究的不断发展，通过蛋白与蛋白间的相互作用在生物学上的功能逐渐被发现出来，蛋白间的相互作用能影响细胞的活性，部分蛋白间的相互作用对生物体保持正常功能和状态有着决定性的影响，甚至可用来解释和预测各种生命过程及现象。近年来，通过检测蛋白间的相互作用来辅助新药研发，已经成为相关研究工作者关注的焦点。

目前，对蛋白与蛋白间的相互作用的检测与分析方法包括：酵母双杂交系统、串联亲和纯化技术、凝胶过滤层析、酶联免疫吸附试验、表面等离子体共振、等温量热滴定和萤光共振能量转移技术等，这些方法都能较好地检测蛋白与蛋白间的相互作用。但这些方法或检测时间较长，或需要昂贵的专用科学仪器，或需要购买较多的费用不菲的材料。因而，一种简单实用、高效灵敏且时间与费用花费较少的检测方法是目前亟需的。

Promega公司开发了使用萤光素酶开发了一种产品NanoBiT，利用双分子萤光互补系统在细胞内检测蛋白与蛋白间的相互作用，适用于多种生物学实验。然而，目前的双分子萤光互补系统均应用于细胞内检测，其具体过程为：构建两个重组质粒A和B，重组质粒A包含目标检测蛋白A基因和萤光素酶基因片段，重组质粒B包含目标检测蛋白B基因和萤光素酶互补基因片段；然后，将这两个重组质粒转染至细胞内用于表达融合蛋白；之后，加入萤光素酶底物后，通过观察是否出现萤光来判断目标检测蛋白A和目标检测蛋白B之间是否发生相互作用。由于在细胞内进行实验，将上述双分子荧光互补系统应用于高通量筛选靶向蛋白间相互作用的活性分子时，存在多种局限性：需要孵育细胞，花费时间长；在细胞内融合表达，无法定量把控融合蛋白的表达效率；由于细胞膜的透膜率、外排泵的效率和代谢酶的水平不确定，活性分子和萤光素酶底物在细胞内的浓度无法定量，导致较高的假阴性概率。因而，现有双分子萤光互补系统在细胞内检测蛋白与蛋白间的相互作用，不适用于靶向蛋白间相互作用的活性分子的高通量筛选。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种体外检测蛋白间相互作用的方法，旨在解决现有技术所存在的花费时间长、假阴性概率高等技术问题。

本发明的另一目的在于提供一种检测试剂盒，用于体外检测蛋白间相互作用，旨在简化操作过程，简单实用、高效灵敏。

本发明的又一目的在于提供上述体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒在高通量筛选靶向蛋白间相互作用的活性分子中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种体外检测蛋白间相互作用的方法，在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：

S01、构建第一重组质粒，所述第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第一重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第一融合蛋白；

所述第一融合蛋白中含由所述第一检测蛋白基因表达的第一检测蛋白，以及由所述萤光素酶基因片段表达的萤光素酶蛋白片段；

S02、构建第二重组质粒，所述第二重组质粒中包含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第二重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第二融合蛋白；