[发明专利]体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的体外检测蛋白间相互作用的方法，其特征在于，在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：

S01、构建第一重组质粒，所述第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第一重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第一融合蛋白；

其中，构建第一重组质粒pCU231：bla P_φ10-6×His-smBiT-nusB-T_φ的过程如下：

选择pETMCSIII作为质粒载体，用于过表达N-端组氨酸标记的重组蛋白；

采用引物N smbit_F和N lg/smbit_R从质粒pBiT2.1-N [TK/SmBiT]上扩增含萤光素酶基因片段smBiT的smBiT-linker片段；

使用NdeI-NcoI酶切，在pETMCSIII的NdeI-NcoI酶切位点上插入smBiT-linker片段，得到质粒载体pCU180；

采用引物smbit nusB_F和smbit nusB_R从质粒pNG130扩增枯草芽孢杆菌nusB基因，得到含第一检测蛋白基因的nusB片段；使用EcoRI和Acc65I酶切，将nusB片段插入pCU180的EcoRI和Acc65I酶切位点位点上，得到含萤光素酶基因smBiT和第一检测蛋白基因nusB的重组质粒载体pCU231；

所述第一融合蛋白中含所述第一检测蛋白基因表达的第一检测蛋白，以及所述萤光素酶基因片段表达的萤光素酶蛋白片段；

S02、构建第二重组质粒，所述第二重组质粒中包含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第二重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第二融合蛋白；

其中，构建质粒pCU235：bla P_φ10-lgBiT-nusE-6×His-T_φ的过程如下：

选择pNG209作为质粒载体，用于过表达C-端组氨酸标记的重组蛋白；

采用引物对C_hisoligo_1和C_hisoligo_2扩增寡聚核苷酸接头片段，得到寡聚核苷酸接头片段hisoligo；将pNG209的限制性内切酶NdeI-NcoI 片段进行酶切，在该酶切片段接上退火的寡聚核苷酸接头片段hisoligo，得到pCU198；

采用引物N_lgbit F和N_lg/smbit R从质粒pBiT1.1-N[TK/LgBiT]上扩增含萤光素酶互补基因lgBiT的lgBiT-linker片段；在pCU198的NdeI-NcoI位点上插入lgBiT-linker片段，得到质粒载体pCU202；

取枯草芽孢杆菌nusE基因，采用引物N_nusE_F和N_nusE_R从载体pNG134进行扩增，得到含第二检测蛋白基因的nusE片段；将nusE片段插入pCU202的克隆位点上，得到含萤光素酶互补基因片段lgBiT和第二检测蛋白基因nusE的重组质粒载体pCU235；

所述第二融合蛋白中含所述第二检测蛋白基因表达的第二检测蛋白，以及所述萤光素酶互补基因片段表达的萤光素酶互补蛋白片段；所述萤光素酶互补蛋白片段与所述萤光素酶蛋白片段互补结合，能够形成一个完整的且能催化萤光素酶底物发光的萤光素酶；

S03、将所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白在细胞外孵育，加入所述萤光素酶底物，检测萤光发射情况；

当出现萤光发射现象时，指示所述第一检测蛋白与所述第二检测蛋白之间存在相互作用；当没有出现萤光发射现象时，指示所述第一检测蛋白与所述第二检测蛋白之间不存在相互作用；

引物N smbit_F的序列为TGGTAAAGCCCATATGGTCTTCACACTC；

引物N_lg/smbit R的序列为AGCGGCCCCATGGGGTACCTCTAGAAG

ATCTGCTAG；

引物C_hisoligo_1的序列为TATGCCATGGGGGCCCCACCATCACCAT

CACCATTAA；

引物C_hisoligo_2的序列为CATGTTAATGGTGATGGTGATGGTGGG

GCCCCCATGGCA；

引物N_lgbit F的序列为GGTAAAGCCCATATGGTGACCGGCTACC；

引物N lg/smbit_R的序列为AGCGGCCCCATGGGGTACCTCTAGAAG

ATCTGCTAG；

引物N_nusE_F的序列为GGCTAATCGAATTCAGTCATGGCAAAAC；

引物N_nusE_R的序列为TCCGCAGGTACCTTACAGTTTGATCTC

AAC；

引物smbit nusB_F的序列为CGGCGAGAATTCAGTCATGAAAGAAG；

引物smbit nusB_R的序列为GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG。