[发明专利]一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）OA人工抗原的制备

用活泼酯法将OA与牛血清白蛋白进行偶联，将产物用PBS稀释，得到浓度为0.8～1.2mg/mL的检测完全抗原OA-BSA，其偶联比为10:1～12:1；

（2）样品垫的处理

将BSA、PEG4000、PVP40000和Tween-20加至PBS中，得到样品垫处理液，将样品垫浸泡于样品垫处理液中，干燥；

所述的样品垫处理液中的各物质质量分数分别为BSA 1～3 %、PEG4000 1～3%、PVP40000 1～3%、Tween-20 1～3 %和PBS余量，上述物质总计为100%；

（3）结合垫的处理

用胶体金溶液标记OA单抗，得到金标抗体复合物，将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，金标抗体的喷量为0.8～2 μL/cm，干燥；

（4）硝酸纤维素膜的处理

将步骤（1）制备的检测完全抗原OA-BSA用PBS稀释，得到浓度为0.1～0.6μg/mL的OA-BSA完全抗原稀释液；制备超纯水复溶沉淀FM-BSA，用PBS稀释600倍，得到FM-BSA稀释液；再将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到荧光微球与OA-BSA的混合液，划膜于硝酸纤维素膜的检测线上，其中，OA-BSA的浓度为0.3mg/mL；

将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的质控线上；

（5）试纸的制备

在PVC底板上，依次粘贴步骤（2）制备的样品垫、步骤（3）制备的结合垫、步骤（4）制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸；

步骤（1）、步骤（2）和步骤（4）中所述的PBS的浓度为15mmol/L ，pH=7.4。

2.根据权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的OA单抗的制备方法为：用活泼酯法将OA与人的免疫球蛋白进行偶联，得到产物用PBS稀释，得到免疫抗原OA- IgG，用免疫抗原OA- IgG免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌OA单抗的细胞株，再用腹水法制备OA单抗，纯化，得到纯化的OA单抗；

所述的免疫抗原OA- IgG的浓度为0.8～1.2 mg/mL，偶联比为10:1～12:1；

所述的OA单抗的浓度为2.0～3.0 mg/mL。

3.根据权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述的胶体金溶液的制备方法为：将100 mL双蒸水与0.5～1.5 mL浓度为1%氯金酸溶液混合，加热沸腾，然后加入1～3mL浓度为1%柠檬酸三钠继续沸腾，当溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温，再按照每毫升溶液中加入8μL浓度为250mM的K₂CO₃溶液的方法调节pH值，即得所述的胶体金溶液，含胶体金的粒径为20 nm。

4.根据权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的用胶体金溶液标记纯化的OA单抗的方法为将胶体金溶液与OA单抗混合，室温下静置；

标记量为每毫升胶体金溶液标记4μL纯化的OA单抗。

5.根据权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA的制备方法为：将荧光微球与超纯水混合，加入EDC和NHS，避光反应30min，再加入BSA，封闭1h，离心，即得到所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA。

6.根据权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的检测完全抗原OA-BSA的浓度为1.0 mg/mL，偶联比为10:1；

步骤（3）中所述的将金标抗体复合物喷涂于结合垫上时，金标抗体的喷量为1.6 μL/cm；

步骤（4）中所述的OA-BSA完全抗原稀释液的浓度为0.5 μg/mL。

7.权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的应用，其特征在于：将所述的荧光淬灭试纸用于检测大田软海绵酸。