[发明专利]一种兰科植物原生质体的制备及转化方法和应用

说明书

本发明涉及涉及一种原生质体的制备和转化方法，具体涉及一种兰科植物原生质体的制备及转化方法和应用，所述方法包括如下步骤：选取兰科植物组织，采用PIS酶溶液进行酶解，分离原生质体；其中，所述PIS酶溶液中包括纤维素酶、果胶酶、CaCl₂、D‑甘露醇、KCl、BSA和MES。本发明在制备兰科植物原生质体的过程中采用优化的PIS酶溶液，对PIS酶溶液的组分进行调整，增强各组分在酶解中的相互作用，使其更加适合兰科植物的酶解，酶解过程中配合特定的转速和暗培养时间，能够最大限度的酶解完全，提高了原生质体的制备效率，高效获得大量的优质原生质体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种原生质体的制备和转化方法，具体涉及一种兰科植物原生质体的制备及转化方法，更具体地，涉及一种兰科植物原生质体的制备及转化方法和应用。

背景技术

植物原生质分离及转化技术已在多种植物中实现(拟南芥、水稻、小麦、生菜等)，对推动本物种的科学研究起到重要作用，但是由于原生质体制备方法和条件会因物种和材料类型的差异而不同，因此针对特定物种需要对分离和转化方法进行优化和再开发。

蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物，是兰科植物中栽培最广泛，最受欢迎的种类之一。因其花姿高雅，花色美丽，花期较长，在众多的热带兰中有“洋兰皇后”的美称。目前关于蝴蝶兰组织培养的研究较多，多采用组织培养来繁殖种苗，进行工厂化生产，而关于原生质体的分离的报道尚少，现有方法仅可以实现蝴蝶兰原生质体的制备，但是是针对胚性愈伤组织培养得到的悬浮细胞为材料来源的原生质体的制备方法，限制了其应用领域；并且目前没有对蝴蝶兰原生质体进行转化的方法。

“蝴蝶兰原生质体提取方法的优化”《植物生理学通报》第44卷第6期，2008年12月，其公开了同一种条件下1g蝴媒兰叶片加入10mL酶解液中，酶解液含1.0％纤维素酶R-10、1.0％果胶酶、0.5mol/L甘露醇，酶解3h，有活力的原生质体产量最高，其产量为1.3×10⁵个/g，活性达81.90％，但采用上述方法制备得到的原生质体转化效果不好。CN 106167787A公开了一种光皮桦木质部原生质体制备及瞬时转化的方法，其提取了光皮桦木的原生质体并实现了瞬时转化；CN107488675A公开了一种油菜原生质体的分离及转化方法，其提取了油菜原生质体并实现了转化；但蝴蝶兰与光皮桦木、油菜并不相同，直接将光皮桦木或油菜的原生质体制备和转化的方法用于蝴蝶兰，其转化效果并不显著。

兰花原生质体转化方法至今仍未有报道，但其在兰花研究中起重要作用，是兰花研究的有利方法。因此开发出一种蝴蝶兰原生质体的高效制备和转化方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兰科植物原生质体的制备及转化方法和应用，本发明以蝴蝶兰叶片为材料来源，进行酶解可高效获得大量的优质原生质体，材料来源广泛，制备效率高。

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种兰科植物原生质体的制备方法，包括如下步骤：

选取兰科植物组织，采用PIS酶溶液进行酶解，分离原生质体；

其中，所述PIS酶溶液中包括纤维素酶、果胶酶、CaCl₂、D-甘露醇、KCl、BSA和MES。

本发明中，通过选取兰科植物组织与PIS酶溶液进行酶解，通过对PIS酶溶液中组分的调整，使其更加适合兰科植物的酶解，能够最大限度的酶解完全，能够高效获得大量的优质原生质体，为后续原生质体的转化奠定基础，其中，所述PIS酶溶液为ProtoplastIsolation Solution的缩写，其中包括了纤维素酶、果胶酶、CaCl₂、D-甘露醇、KCl、BSA和MES。

根据本发明，所述兰科植物组织为兰科植物叶片、兰科植物类原球茎或兰科植物愈伤组织中的任意一种或至少两种的组合。