[发明专利]一种兰科植物原生质体的制备及转化方法和应用

权利要求书

1.一种兰科植物原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

选取兰科植物组织，采用PIS酶溶液进行酶解，分离原生质体；

其中，所述PIS酶溶液中包括纤维素酶、果胶酶、CaCl₂、D-甘露醇、KCl、BSA和MES。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述兰科植物组织为兰科植物叶片、兰科植物类原球茎或兰科植物愈伤组织中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述兰科植物包括蝴蝶兰、春兰、蕙兰、大花蕙兰、建兰、寒兰、墨兰、大花杓兰或兜兰中的任意一种或至少两种的组合，优选为蝴蝶兰；

优选地，所述兰科植物叶片的叶龄为1-4个月，优选为1-2个月。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述兰科植物组织与PIS酶溶液的质量体积比为1:(3-10)，优选为1:(3-8)；

优选地，所述酶解的具体步骤为在转速为30-100rpm的条件下暗培养4-10h；

优选地，所述转速为40-80rpm，优选为40-60rpm；

优选地，所述暗培养的时间为4-8h，优选为5-6h；

优选地，所述PIS酶溶液中包括质量体积分数为0.5-2％纤维素酶、质量体积分数为0.5-2％的果胶酶、5-15mM CaCl₂、15-25mM pH5-6的MES、0.1-1M D-甘露醇、15-25mM KCl和质量体积分数为0.05-0.5％BSA；

优选地，所述PIS酶溶液中包括质量体积分数为0.8-1.2％纤维素酶、质量体积分数为0.8-1.2％的果胶酶、8-12mM CaCl₂、18-23mM pH5-6的MES、0.2-0.6M D-甘露醇、18-23mMKCl和质量体积分数为0.08-0.2％BSA。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述叶片酶解前还包括叶片切割的步骤；

优选地，所述切割为将叶片切割成宽0.1-1mm的细长条，优选为0.3-0.8mm，进一步优选为0.4-0.6mm；

优选地，所述切割为将叶片切割成长度不大于1.5cm的细长条，优选为0.8-1.2cm。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述叶片酶解后还包括过滤、清洗和计数的步骤；

优选地，所述过滤为采用30-50μm的筛网进行过滤，优选采用40μm细胞筛进行过滤；

优选地，所述过滤的次数为1-3次；

优选地，所述清洗为向过滤后的酶解混合物中添加W5溶液，离心得到所述原生质体细胞；

优选地，所述W5溶液与PIS酶溶液的体积比为(0.5-5):1，优选为(1-3):1；

优选地，所述离心的转速为50-200g，优选为80-150g；

优选地，所述离心的时间为3-10min，优选为3-8min；

优选地，所述离心的次数为1-3次。

6.一种根据权利要求1-5中任一项所述制备得到的原生质体用于转化；

优选地，所述原生质体的细胞浓度为(0.1-3)×10⁶个/mL，优选为(0.5-2)×10⁶个/mL。

7.一种兰科植物原生质体的转化方法，其特征在于，采用权利要求1-5中任一项所述制备得到的原生质体，包括如下具体步骤：

(1’)将质粒和原生质体细胞混匀，加入PEG溶液，室温孵育；

(2’)向步骤(1’)孵育后的溶液中加入W5溶液，离心；

(3’)向步骤(2’)离心后的溶液中加入W5溶液重悬后培养。