[发明专利]高油酸花生快速选种试剂盒

权利要求书

1.一种高油酸花生快速选种试剂盒，其特征在于，所述高油酸花生快速选种试剂盒包括：有高油酸花生FAD2A突变基因型引物对，高油酸花生FAD2B突变基因型引物对，花生FAD2A野生基因型引物对，花生FAD2B野生基因型引物对，TaqDNA聚合酶、无菌去离子水、阴性标准品、核酸免疫胶体金试纸条；

所述FAD2A突变基因型引物对，包括突变型FAD2A基因序列的正向引物FAD2A-A，引物5’端用FAM标记，正向引物序列为FAD2A-A：5’-FAM-GTTTTGGGACAACACTTCTTT-3’，反向引物FAD2-R，引物5’端用生物素标记(biotin)，反向引物序列为FAD2-R：5’-biotin-CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT-3’，所述产物长度为557bp；

所述FAD2B突变基因型引物对，包括突变型FAD2B基因序列的正向引物FAD2B-A，引物5’端用VIC标记，正向引物序列为FAD2B-A：5’-VIC-AACACTTGGYCGCGGTTT-3’，反向引物FAD2-R，引物5’端用生物素标记(biotin)，反向引物序列为FAD2-R：5’-biotin-CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT-3’，所述产物长度为539bp；

所述FAD2A野生基因型引物对，包括野生型FAD2A基因序列的正向引物FAD2A-F，引物5’端用异硫氰酸荧光素标记(fluorescein isothiocyanate，FITC)，正向引物序列为FAD2A-F：5’-FITC-GATTACTGATTATTGACTTGCTTTG-3’，反向引物FAD2-R，引物5’端用生物素标记(biotin)，反向引物序列为FAD2-R：5’-biotin-CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT-3’，所述产物长度为1200bp；

所述FAD2B野生基因型引物对，包括野生型FAD2B基因序列的正向引物FAD2B-F，引物5’端用地高辛标记(digoxin)，正向引物序列为FAD2B-F：5’-digoxin-CAGAACCATTAGCTTTGTAGTAGTG-3’，反向引物FAD2-R，引物5’端用生物素标记(biotin)，反向引物序列为FAD2-R：5’-biotin-CTCTGACTATGCATCAGAACTTGT-3’，所述产物长度为1241bp。

2.根据权利要求1所述的高油酸花生快速选种试剂盒，其特征在于所述高油酸花生快速选种试剂盒中的核酸免疫胶体金试纸条的制备方法如下：

(1)胶体金溶液的制备：取49.5mL去离子水置于处理好的锥形瓶中，加入0.5mL 1％的氯金酸，放入微波炉中加热，当溶液沸腾时加入0.8mL的1％柠檬酸钠，继续放入微波炉中加热，变为葡萄酒红色，取下冷却至室温，避光4℃保存备用；

(2)胶体金标记链霉亲和素的制备：取50mL胶体金溶液，置于三角锥瓶中，用0.1mol/L的碳酸钾溶液调其PH值至8.5，用移液器吸取220μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min，加入3％的聚乙二醇0.875mL作为稳定剂，混匀15min，封住三角锥瓶的瓶口，4℃保存备用；

(3)核酸免疫胶体金试纸条的组装：所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置；所述结合垫上包被胶体金标记链霉亲和素；所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔分别设置质控线C线、FAD2A野生型检测线T1线、FAD2A突变型检测线T2线、FAD2B野生型检测线T3线、FAD2B突变型检测线T4线；所述C线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.05mL/mL的BSA化生物素；所述T1线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.125mg/mL的抗FITC抗体；所述T2线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.125mg/mL的抗FAM抗体；所述T3线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.025mg/mL的抗地高辛抗体；所述T4线处的硝酸纤维素膜上包被标记浓度为0.125mg/mL的抗VIC抗体；所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。

3.根据权利要求1所述的高油酸花生快速选种试剂盒，其特征在于所述一种高油酸花生快速选种试剂盒检测花生高油酸基因的步骤如下：

(1)花生基因组DNA提取：取花生新生叶1片(约l0mg)，置于1.5mL EP管中，加入液氮，用塑料小研磨棒将叶片迅速研磨成粉末；加入400μL提取液(包含浓度200mmol/L的Tris-HCl溶液(PH8.0)，浓度250mmol/L的氯化钠溶液，浓度25mmol/L的EDTA溶液，浓度0.5％的SDS溶液，经高压蒸汽灭菌后使用。使用前加入浓度为1％的β-巯基乙醇溶液。)，震荡混匀，静置10min；加入200μL 5mol/L的醋酸钾溶液(pH5.0或不调pH)，震荡混匀，静置15min；12000r/min转速离心2min，取上清液400μL移入另一个l.5mL EP管中，加入等体积异丙醇；轻轻混匀后于室温下静置2分钟，12000r/min转速离心5min，弃上清液，沉淀再用75％酒精洗涤1～2次，12000r/min转速离心5min；在室温下开盖放置15min，加入10μL蒸馏水，溶解沉淀，即得到花生叶片基因组粗提液，用分光光度计和凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，并稀释至合适的浓度备用；

(2)PCR反应：将步骤⑴中提取得到的DNA作为模板，以无核酸序列的无菌去离子水为阴性标准品，

所述普通PCR反应体系为：1μLDNA模板(30ng/μL)、2μL Buffer(10×)、2μL dNTP(2.5mmol/L)、0.2μL Taq、1μL正向引物(10μmol/L)、1μL的反向引物(10μmol/L)，加ddH2O至25μL；

所述普通PCR反应条件为：95℃，5min；95℃30s，48℃30s，72℃45s，30cycles；72℃，10min；4℃保存备用；

所述多重检测PCR反应体系为：1.5μLDNA模板(30ng/μL)、2.5μL Buffer(10×)、2μLdNTP(2.5mmol/L)、0.2μL Taq、1μL野生型正向引物(10μmol/L)、1μL突变型正向引物(10μmol/L)、0.25μL的反向引物(10μmol/L)，加ddH₂O至25μL；

所述多重检测PCR反应条件为：94℃，5min；94℃40s，55℃40s，72℃90s，30cy cles；72℃，5min；4℃保存备用；

根据需要选择相应的普通PCR反应或多重PCR反应，配制相应的反应体系和条件进行PCR扩增反应；

(3)结果检测：取步骤(2)中的每种扩增产物5μL，添加至90μL 0.01mol/L PBS，充分混合后，滴加到核酸免疫胶体金试纸条的样品垫上，2～3min后肉眼观察结果；

(4)结果判读：肉眼直接观察条带，进行判读。