[发明专利]用于C5aR1基因敲除的sgRNA、载体以及构建方法和检测方法

说明书

本发明涉及基因敲除领域，具体而言，涉及用于C5aR1基因敲除的sgRNA、载体以及构建方法和检测方法。用于C5aR1基因敲除的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明经过对待敲除序列的分析，共涉及了14个sgRNA，经过活性检测，得到这两条sgRNA，经过后续实验验证，其与Cas9蛋白配合，得到C5aR1基因敲除的小鼠。

技术领域

本发明涉及基因敲除领域，具体而言，涉及用于C5aR1基因敲除的sgRNA、载体以及构建方法和检测方法。

背景技术

慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一种慢性气道炎症性疾病，气道重塑(airway wall remodeling)是其主要的病理特点之一，也是疾病进展难愈的重要原因。慢性阻塞性肺病的发生与气道和肺对有害气体或颗粒的慢性炎症反应增强有关。

目前认为，气道重塑除了在气道炎症基础上的异常修复过程外，还可能与氧化损伤、蛋白酶-抗蛋白酶失衡以及凋亡及凋亡细胞的清除异常等机制有关。虽然临床上使用吸入糖皮质激素等针对气道炎症的治疗，但治疗效果仍不满意，提示已知的COPD气道重塑机制仍不完善，亟需进一步明确气道重塑的其他机制，探索和寻找新的治疗靶点，干预和逆转疾病过程。

过敏毒素C5a(Complement component 5a，C5a)是补体系统中的一员，大量证据证实了C5a在急性炎症反应中发挥了非常重要的作用，但其在慢性炎症反应中的作用鲜有提及。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

在前期工作中，发明人发现气道诱导痰C5a水平不仅在COPD急性加重的患者中升高，在稳定期COPD患者气道诱导痰中同样升高，提示C5a不仅在急性炎症中发挥作用，在COPD稳定期的慢性气道炎症的维持和发展中也可能具有重要的作用，但其具体作用和作用机制仍不清楚。深入地研究C5a在气道重塑中的作用和分子机制，对于寻找新的COPD气道重塑的治疗靶点具有重要意义。

基于上述内容，本发明的目的在于提供构建C5aR1基因敲除小鼠的方法，其包括设计用于C5aR1基因敲除的sgRNA及其载体，进而通过注射相应的sgRNA与Cas9蛋白，得到C5aR1基因敲除的小鼠，以用于上述的研究。

本发明提供了用于C5aR1基因敲除的sgRNA，所述sgRNA的核酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明经过对待敲除序列的分析，共涉及了14个sgRNA，经过活性检测，得到这两条sgRNA，经过后续实验验证，其与Cas9蛋白配合，得到C5aR1基因敲除的小鼠。

本发明还提供了用于C5aR1基因敲除的T7-sgRNA，所述T7-sgRNA的核酸序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的用于C5aR1基因敲除的sgRNA，采用载体进行转录，其用于转录的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，经转录，得到足量用于注射的sgRNA。

本发明还提供一种载体，含有上述的T7-sgRNA。

该载体用于转录用于C5aR1基因敲除的sgRNA，得到足量用于注射的sgRNA。

本发明还提供了一种构建C5aR1基因敲除小鼠的方法，如SEQ ID NO.1所示的sgRNA与Cas9蛋白或如SEQ ID NO.2所示的sgRNA与Cas9蛋白转入到小鼠受精卵中，后续经过基因型检测，得到C5aR1敲除的模型小鼠。

进一步地，所述转入采用显微注射的方式。