[发明专利]一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用

说明书

本发明公开了一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用。该方法包括以下步骤：(1)将沙门氏菌外膜蛋白的基因克隆到表达载体中，然后将得到的重组表达载体导入到宿主沙门菌中，得到重组菌株；(2)将重组菌株扩大培养，再离心收集菌体并冷冻保存，得到冷冻菌体；(3)向冷冻菌体中加入蛋白裂解液，并加入苯甲基磺酰氟溶液，恒温超声破碎，收集蛋白质沉淀；(4)向蛋白质沉淀中加入外膜蛋白提取液，混匀后置于4℃条件下孵育，然后离心，收集上清液；(5)将上清液分离纯化，得到沙门氏菌外膜蛋白。本发明方法步骤简单、操作方便，适用于高纯度高活性外膜蛋白的大量提取，可同时满足蛋白活性、结构和疫苗研发等后续实验要求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用。

背景技术

沙门菌是公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病原菌，是各国公认、全球报道最多、世界最常见引发食源性疾病的首要病原菌，能引起胃肠炎、菌血症和伤寒等疾病。沙门菌属的大部分成员具有很强的致病性。沙门菌属于肠杆菌科沙门菌属，为两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌外，其余都有周身鞭毛，能运动，大多数具有纤毛，需氧或兼性厌氧菌。沙门菌最常侵害幼年、青年动物，使之发生败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症。

外膜蛋白是原核生物细胞膜的重要组成成分之一，在维持细菌正常形态结构及细菌在机体内的生存和繁殖中发挥着不可替代的作用。外膜蛋白占细胞外膜成分的1/2左右，在维持细胞膜的流动性、维持细胞结构和保证物质转运等方面发挥重要作用。同时，外膜蛋白与细菌的致病性、抗药性和免疫原性等方面也有一定的联系。近年来，细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(OMP)的免疫作用越来越受到科技人员的关注。实验证明，OMP具有良好的免疫原性，不仅可刺激体液免疫，而且也可刺激细胞免疫作用。

现阶段，常用于提取外膜蛋白的方法有碳酸钠法、等密度梯度离心法和Sarkosyl法，Triton-X114法，这些方法对仪器设备的要求比较高，提取过程相对繁琐，同时由于沙门氏菌细胞膜结构的特殊性而很难严格的将同属膜结构的质膜与外膜区分开。因此，现有的方法不适用于提取沙门氏菌的外膜蛋白。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法。该方法步骤简单、操作方便、所需设备少，适于高纯度高活性外膜蛋白的大量提取，质与量可同时满足蛋白活性、结构和疫苗研发等后续实验要求。

本发明的另一目的在于提供所述适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)将沙门氏菌外膜蛋白的基因克隆到表达载体中，得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入宿主沙门菌中，得到重组菌株；

(2)将步骤(1)中得到的重组菌株进行扩大培养，然后加入阿拉伯糖，再离心收集菌体并冷冻保存，得到冷冻菌体；

(3)向步骤(2)中得到的冷冻菌体中加入蛋白裂解液重悬菌体，并加入苯甲基磺酰氟溶液，混合均匀后恒温超声破碎，然后离心、收集上清，得到上清液I；将上清液I再次离心，收集蛋白质沉淀；

(4)向步骤(3)中收集的蛋白质沉淀中加入外膜蛋白提取液，重悬沉淀并充分混匀后置于4℃条件下震荡孵育3～4h，然后离心、收集上清，得到上清液II；

(5)将步骤(3)中得到的上清液II进行蛋白分离纯化，得到沙门氏菌外膜蛋白。

步骤(1)中所述的沙门氏菌外膜蛋白的基因是以沙门菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增得到。

所述的沙门菌为鼠伤寒沙门菌；优选为鼠伤寒沙门菌SL1344。