[发明专利]一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用

权利要求书

1.一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将沙门氏菌外膜蛋白的基因克隆到表达载体中，得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入宿主沙门菌中，得到重组菌株；

(2)将步骤(1)中得到的重组菌株进行扩大培养，然后加入阿拉伯糖，再离心收集菌体并冷冻保存，得到冷冻菌体；

(3)向步骤(2)中得到的冷冻菌体中加入蛋白裂解液重悬菌体，并加入苯甲基磺酰氟溶液，混合均匀后恒温超声破碎，然后离心、收集上清，得到上清液I；将上清液I再次离心，收集蛋白质沉淀；

(4)向步骤(3)中收集的蛋白质沉淀中加入外膜蛋白提取液，重悬沉淀并充分混匀后置于4℃条件下震荡孵育3～4h，然后离心、收集上清，得到上清液II；

(5)将步骤(3)中得到的上清液II进行蛋白分离纯化，得到沙门氏菌外膜蛋白；

步骤(4)中所述的外膜蛋白提取液的组成成分为：2％(w/v)十二烷基-β-D-麦芽糖苷，pH 7.0、50mM Tris-HCL以及10％(v/v)甘油；

步骤(5)中所述的分离纯化通过如下步骤实现：

(A)向上清液II中加入Ni-NTA柱填料和咪唑，然后置于4℃条件下震荡孵育1～2h，得到Ni-NTA混悬液；

(B)将Ni-NTA混悬液转移到柱子中，弃去上清，然后将Ni-NTA柱用清洗液冲洗，再用洗脱液洗脱，得到纯化后的沙门氏菌外膜蛋白；

步骤(A)中所述的Ni-NTA柱填料与上清液II的体积比为1：1000；

步骤(A)中所述的咪唑的添加量为按其在体系中的终浓度为50mM添加；

步骤(B)中所述的清洗液的组成成分为：pH 7.5、20mM Tris-HCl，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-D-麦芽糖苷和50mM咪唑；

步骤(B)中所述的洗脱液的组成成分为：pH 7.5、20mM Tris-HCl，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-D-麦芽糖苷和500mM的咪唑。

2.根据权利要求1所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的蛋白裂解液的组成成分为：pH 7.0、50mM Tris-HCL以及10％(v/v)甘油。

3.根据权利要求1所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的菌体与蛋白裂解液的体积比为1：5；

步骤(3)中所述的苯甲基磺酰氟溶液为饱和苯甲基磺酰氟异丙醇溶液；

步骤(3)中所述的苯甲基磺酰氟溶液与蛋白裂解液的体积比为1：500；

步骤(4)中所述的蛋白质沉淀与外膜蛋白提取液的体积比为1：10。

4.根据权利要求1所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的阿拉伯糖的添加量为按其在体系中的终浓度为0.2％(w/v)计算。

5.根据权利要求1所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于：还包括将步骤(1)中的重组菌株利用氯霉素药板进行筛选的步骤；所述的氯霉素药板中氯霉素的浓度为25μg/mL。

6.根据权利要求1所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的表达载体为带有组氨酸标签的原核表达载体；

步骤(1)中所述的沙门菌为鼠伤寒沙门菌；

步骤(2)中所述的扩大培养所用培养基为含有25μg/mL氯霉素的LB液体培养基。