[发明专利]抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用。本发明以E.coli MG1655为出发菌株，首次提出大肠杆菌自身代谢途径可能影响全长IgG抗体表达的新策略，阐明了大肠杆菌中丙酮酸代谢路径对IgG表达的影响，同时引入了sRNA技术调控基因的表达，进而间接提高了IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用。

背景技术

过去三十年中，生物制药市场已经成为全球医药市场的重要组成部分，其占全球医药销售额的40％左右，2012年，生物制药市场的营业额约为 100-120亿美元/年，其主要来自于单克隆抗体和抗体片段的市场。特别是，单克隆抗体是生物医药企业最重要的产品之一，其中几种治疗性产品成为了重磅炸弹，例如，Avastin(阿瓦斯汀，化学名为贝伐单抗(bevacizumab))、 Herceptin(赫赛汀，化学名为曲妥珠单抗(trastuzumab))、Remicade(类克，化学名为英夫利昔单抗(Infliximab))、Rituxan(美罗华，化学名为利妥昔单抗(rituximab))、Humira(修美乐，化学名为阿达木单抗(adalimumab)) 和Erbitux(爱必妥，化学名为西妥昔单抗(cetuximab))。单克隆抗体，主要是免疫球蛋白G(IgG)，截止到2012年，美国食品药品监督管理局(FDA) 批准了32种IgGs上市。

按照结构的不同，单克隆抗体可以分为5种免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、 IgE和IgD。如图1所示，免疫球蛋白G(IgG)是由两个相同的分子量较小的轻链(LC)和两个相同的分子量较大的重链(HC)组成的对称单体，并通过二硫键组装完成。根据氨基酸序列变化大小，可以将IgG分为可变区 (variable region,V区)和恒定区(constant region，C区)，其中，可变区序列变化很大，而恒定区序列相对稳定。轻链(light chain，LC)是由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成，约250个氨基酸残基，分子量大小约为 25kD，可以分为kappa和lambda两个亚型。重链(heavy chain，HC)是由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成，约500个氨基酸残基，分子量大小约为50kD，重链恒定区由C_H1、C_H2和C_H3组成。Fv片段由轻链可变区和重链可变区组成，是抗原结合的部位。Fab片段由轻链和重链可变区以及重链恒定区的C_H1组成。Fc片段由重链恒定区的C_H2和C_H3组成，是与效应分子或者细胞相互作用的部位。

人工合成sRNA(synthetic small regulatory RNA)是一段短小且非编码 RNA。它与核糖体竞争性结合靶mRNA(靶信使RNA)，从而阻止靶mRNA 进行后续翻译，进而达到抑制目标基因表达的目的。与传统的基因敲除技术相比，sRNA技术操作简单，便于实施，并且它允许同时筛选菌株中不同的靶基因，实现高通量研究，可以广泛应用于代谢工程和合成生物学。

与哺乳细胞系统相比，大肠杆菌系统具有细胞生长快速、高抗剪切力、成本低廉等优点，成为生产IgG抗体的潜在热门宿主，被广泛研究。

基因表达系统直接影响大肠杆菌中外源基因的表达水平，因此增加大肠杆菌中全长IgG抗体表达的研究主要集中在基因的转录和翻译水平上，如启动子的筛选、温度和诱导剂浓度的优化、共表达分子伴侣等，未见大肠杆菌自身碳源代谢对IgG抗体表达影响的研究。

发明内容