[发明专利]一种脐带间充质干细胞复合外泌体及其制备方法在审
| 申请号： | 201811354330.5 | 申请日： | 2018-11-14 |
| 公开（公告）号： | CN109295001A | 公开（公告）日： | 2019-02-01 |
| 发明（设计）人： | 姜大奎;戴琳 | 申请（专利权）人： | 姜大奎 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N5/0775;C12N15/87 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 122000 辽宁省朝阳*** | 国省代码： | 辽宁;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 复合 脐带间充质干细胞 人脐带间充质干细胞 包载 制备 人血管内皮细胞 干细胞技术 血管生成 电穿孔 增殖 成功率 抽取 合成 迁移 体内 修复 治疗 | ||
1.一种脐带间充质干细胞复合外泌体，其特征在于，所述复合外泌体为内部包载有mir-181b的脐带间充质干细胞外泌体。
2.一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，该制备方法用于制备权利要求1所述的复合外泌体，包括如下步骤：
(1)人脐带间充质干细胞的培养；
(2)人脐带间充质干细胞外泌体提取、纯化；
(3)合成mir-181b；
(4)电穿孔mir-181b包载于步骤(2)中纯化的脐带间充质干细胞外泌体，获取复合外泌体样品；
(5)复合外泌体样品进行膜修复；
(6)复合外泌体的抽取、纯化与保存。
3.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)人脐带间充质干细胞的培养，具体操作是：取生长良好的人脐带间充质干细胞，用DMEM/F12培养液进行细胞计数，达到106/ml后原代培养，按5×106cells/ml接种到T75细胞培养瓶，置于CO2体积浓度为5％的37℃培养箱中培养，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2～P5代的人脐带间充质干细胞；P2～P5代的人脐带间充质干细胞置于O2体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用DMEM/F12培养液进行培养，直到细胞达70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12h，将无血清的饥饿培养液换为含有10ng/ml表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液，培养至细胞处于对数生长期，收集细胞培养上清液。
4.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的方法为：向1ml含50mM海藻糖的磷酸缓冲盐溶液中分别加入步骤(2)纯化的脐带间充质干细胞外泌体和步骤(3)合成的mir-181b，均匀混合形成混合反应液，混合反应液加入穿孔皿中进行电穿孔；所述混合反应液包括脐带间充质干细胞外泌体100μg～300μg、mir-181b 5～20μl。
5.根据权利要求4所述的一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中电穿孔的穿孔条件为：电压100V、电容125μF、放电时间1ms、放电次数为1次。
6.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞复合外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)的方法为：复合外泌体样品经10万～14万g(RCF)离心力超速离心两次，每次70～90min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载mir-181b的复合外泌体，复合外泌体-80℃保存备用。
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