[发明专利]一种共培养肝细胞和肝窦内皮细胞的技术方法及其应用

说明书

本发明公开了一种共培养肝细胞系与肝窦内皮细胞系的方法及其应用。其特征在于：将肝窦内皮细胞系进行缺氧培养一定时间，然后收获肝窦内皮细胞系，与肝细胞系以一定比例进行共培养。与肝窦内皮细胞系共培养可部分模拟体内肝脏环境，有利于肝细胞功能，并且通过缺氧激活肝窦内皮细胞后，其促进肝细胞功能的能力增强，且不需使用外源的内皮细胞激活剂，减少外源物质的引入，有利于后续的细胞应用。本发明还提供这种共培养方法在包括药物筛选和生物人工肝制备等领域的应用。

技术领域

本发明涉及医学和生物学领域，具体涉及肝细胞和肝窦内皮细胞的共培养方法以及共培养的肝细胞和肝窦内皮细胞在制备生物人工肝或药物筛选中的应用。

背景技术

体外培养的肝细胞在多方面具有应用或潜在应用价值，例如：药物或毒性物质筛选、肝炎病毒感染机制和治疗研究、以及利用培养的肝细胞制备生物人工肝用于肝衰竭的治疗等。但随着培养时间的延长，肝细胞在体外单层培养过程中极易丧失其结构特征和功能(Elaut G，Henkens T，Papeleu P，et al.Molecular mechanisms underlying thededifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures.CurrDrug Metab，2006，7：629-660.)。体外培养肝细胞功能减退的主要原因是肝细胞脱离了体内微环境导致了表型和功能改变。肝细胞功能的维持依赖于肝脏的三维结构、肝细胞与肝细胞、以及肝细胞与间质细胞之间的相互作用。间质细胞在体内通过与肝细胞发生相互作用，如直接接触或旁分泌各类细胞因子、生长因子和细胞外基质，为肝脏细胞提供合适的生存微环境，并促进肝细胞迁移、增殖和分化等。

因此，很多研究者尝试各种模拟体内微环境的方法以提高肝细胞体外增殖和功能，包括三维立体培养、胶原双层凝胶、肝细胞球、肝细胞和间质细胞共培养等。研究发现肝细胞与肝脏非实质细胞(肝窦内皮细胞、枯否氏细胞、肝星形细胞)共同培养，可以使细胞间相互沟通信息，模拟体内环境、维持细胞功能和活力以及诱导细胞分化、调控细胞增殖、提高代谢物产量(Liu Y，Li H，Yan S，et al.Hepatocyte Cocultures with EndothelialCells and Fibroblasts on Micropatterned Fibrous Mats to Promote Liver-Specific Functions and Capillary Formation Capabilities.Biomacromolecules.2014，15(3)：1044-1054.Zinchenko YS，Schrum LW，Clemens M，et al.Hepatocyte andKupffer Cells Co-cultured on Micropatterned Surfaces to Optimize HepatocyteFunction.Tissue Engineering. 2006，12(4)：751-761.张茜，金若敏.细胞共培养技术的研究进展.中国药理学与毒理学杂志，2011，25(3)：330-332)。

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSEC)是肝脏非实质细胞的主要细胞群，占这些细胞数的70％左右。LSEC在肝脏物质交换、代谢、免疫中起着重要作用，并能分泌血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1 (TGF-β1)、肝细胞生长因子(HGF)等多种细胞因子，对维持肝脏功能非常重要。