[发明专利]一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法

说明书

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法专利申请事宜。该方法针对新鲜烟叶中还原酶的提取，具体包括：制备提取液（采用裂解液RIPA、缓冲液NEB或PBS）、烟叶预处理、溶液法提取等步骤。初步测定结果表明，经过相关提取工艺参数优化后，提取液中GSR酶活得到了较好提高，可达2.3×10^‑3U/μg全蛋白，而NR酶活可达6.2×10^‑3U/μg全蛋白，达到了减少杂质蛋白干扰、提升GSR酶和NR酶含量的目的。同时由于相关提取方法简单快速、耗时较短（仅1.5 h左右），因此使得本申请具有较好的科研价值，可为GSR和NR活性分析及其它相关蛋白分析和研究奠定技术基础。

技术领域

本申请属于烟草代谢物技术领域，具体涉及一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法。

背景技术

烟草作为一种较为特殊的经济作物，其产量与品质直接关系到我国国民经济的健康发展。为了研究烟草基因功能，创制新的育种材料，对烟草代谢物进行深入研究和分析显然具有十分重要的意义。

生长发育过程中，植物细胞中多种生理生化反应都可产生活性氧(reactiveoxygen species，ROS)。过高浓度活性氧会对植物细胞发育造成不可逆的损害，因此正常生长条件下，植物细胞中ROS维持在较低的水平，并存在一定的清理机制，以维持其较低水平。然而，干旱、低温、盐胁迫、高温、强光、重金属、紫外辐射、空气中的臭氧（O₃）和SO₂等污染气体、机械损伤等胁迫因素都可引起ROS的大量增加，若不及时清除，就会对植物细胞产生严重伤害。烟草细胞内，谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GSR) 通过抗坏血酸·谷胱甘肽循环途径(Asa·Glu循环)，催化GSSG还原为GSH，通过GSH的再生构成了烟草细胞内的清除ROS的抗氧化系统，并进而维持植物细胞内的氧化还原平衡。

另一方面，硝酸还原酶(nitrae reductase，NR)也是烟草细胞内一种重要的还原酶，NR酶是烟草氮代谢中硝酸盐还原的限速酶和调节酶，可以催化NAD(P)H将NO^3-还原为NO^2-的反应，其作用是将烟草从土壤中吸收的硝态氮还原为亚硝酸盐，然后在亚硝酸盐还原酶作用下继续还原成氨，最后形成蛋白质，是烟草利用氮素的重要途径。硝酸还原酶作用的产物亚硝酸盐是烟草特有亚硝胺的前体物质，而后者是烟叶内的致癌物质。

由于还原酶类代谢物与烟草品质、烟草危害的紧密关联性，因此，对于这类还原酶的深入研究，对于烟草生理生化的深入研究、以及烟草新材料鉴定、新品种培育都具有十分重要的意义。

现有技术中，植物蛋白（包括生物酶）的提取方法主要有两种：溶液法和沉淀法。其中沉淀法因其提取过程中采用了变性剂，会导致部分蛋白酶结构改变并失去活性，因此沉淀法并不适合烟草叶片全蛋白的提取。而在应用溶液法进行提取时，由于不同蛋白（生物酶）特性不同，因此具体提取所选择的提取液及提取工艺也往往缺乏可借鉴性，往往均需重新设计。而现有技术中尚未见到较好的提取还原酶类的提取方法报道。

发明内容

本申请目的在于提供一种提高烟叶提取物中还原酶酶活提取方法，从而为烟草生长代谢研究奠定一定方法学基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，该方法针对新鲜烟叶中还原酶的提取，所述还原酶主要指：谷胱甘肽还原酶（GSR）和硝酸还原酶（NR），具体包括如下步骤：：

（1）制备提取液，具体可采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：

裂解液RIPA ：Tris-Cl（pH 8.0）、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；