[发明专利]一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法

权利要求书

1.一种提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，其特征在于，该方法针对新鲜烟叶中还原酶的提取，具体包括如下步骤：

（1）制备提取液，具体采用裂解液RIPA、NEB或PBS；配方组成为：

裂解液RIPA ：pH 8.0的Tris-Cl、50 mM，EDTA、1mM，SDS、0.1%，NaCl、150 mM，NP-40、1%，PMSF、1 mM；

缓冲液NEB：pH 7.5 的Hepes、20mM，KCl、40 mM，EDTA、1 mM，PMSF、1 mM；

（2）烟叶预处理

将烟草8-12叶期的新鲜烟叶，研磨成粉备用；

（3）溶液法提取

在步骤（2）研磨成粉烟叶样品中加入步骤（1）中制备的提取液，震荡混匀后，冰上静置不少于1h；具体用量方面，研磨成粉烟叶样品100mg，提取液用量为500μl-1mL；

静置完成后，5000~15000rpm离心不少于20min，保留上清液，即为含有还原酶酶活的提取液。

2.如权利要求1所述提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，其特征在于，所述还原酶指：谷胱甘肽还原酶和硝酸还原酶。

3.如权利要求2所述提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（2）中，所述栽培烟草为K326或者NC82品种。

4.如权利要求3所述提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，其特征在于，步骤（1）中PBS的pH=8.0、7.2或者6.0，具体组成为：

pH=8.0的PBS ：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 9.5 mM，NaH₂PO₄、0.5 mM，PMSF、1mM；

pH=7.2的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 7.2 mM，NaH₂PO₄、2.8 mM，PMSF、1 mM；

pH=6.0的PBS：NaCl、137 mM，KCl、2.7 mM，Na₂HPO₄ 1.2 mM，NaH₂PO₄、8.8 mM，PMSF、1 mM。

5.如权利要求4所述提高烟叶提取物中还原酶酶活的提取方法，其特征在于，用于谷胱甘肽还原酶提取时，步骤（1）中，采用ph=8.0的PBS，步骤（3）中，提取液用量为1mL，5000 rpm离心20min；用于硝酸还原酶提取时，步骤（1）中，采用ph=8.0的PBS，步骤（3）中，提取液用量为1mL，13000 rpm离心20min。