[发明专利]一种胆固醇酯酶及其应用

说明书

本发明公开了一种胆固醇酯酶及其应用，胆固醇酯酶的产生菌Fusariumsp.WZ22，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016751。该菌株发酵产生的酶蛋白大小为62KDa，N端序列为甲硫氨酸‑异亮氨酸‑赖氨酸‑脯氨酸‑丙氨酸‑精氨酸，pI=5.18。该酶对胆固醇酯具有良好的降解作用，在血液中血清总胆固醇含量的测定方面具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种胆固醇酯酶及其应用。

背景技术

胆固醇是一种广泛分布于动物体内的不溶于水的脂质类物质，可分为高密度胆固醇和低密度胆固醇两种，前者对人体的心血管有保护作用，而后者则会提高机体患发冠心病的危险性。医学研究表明，胆固醇在血液中会与脂蛋白结合形成极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白与高密度脂蛋白三种脂蛋白，极低密度脂蛋白与低密度脂蛋白在机体代谢过程中可氧化成氧化型低密度脂蛋白，当含量过高时，其携带的胆固醇就易于沉积在人体的动脉壁上，进而引发动脉粥样硬化。由此看来，人体中血清胆固醇的含量与心脏病、糖尿病、动脉粥样硬化、肾病综合症、肝胆系统疾病等多种心脑血管类并发症密切相关。全血总胆固醇的检测对于相关疾病的监控和预防有着极其重要的作用。

胆固醇的检测方法有很多种，在20世纪初期，因受限于当时的检测手段，化学法几乎是唯一的检测方法，其中包括直接反应法、使用有机溶剂部分纯化法、完全分离胆固醇进行检测方法以及采用血清蛋白电泳将胆固醇从结合的蛋白位点上分离出来进行检测等其他方法。然而，化学法在使用过程中具有化学腐蚀、耗时长等缺点。随着科技发展的日新月异，同位素稀释质谱法以其高精度和化学计量的高准确度逐渐为人们所熟知，但其对设备和检测成本要求较高。相比之下，生物酶法检测，条件温和，实时高效，逐步的融合于血清总胆固醇的临床检测当中。胆固醇酯酶作为酶法检测血清总胆固醇的一个关键酶系，在国内很少有相关研究报道。因此，研究和开发高质量的胆固醇酯酶对于临床医学预防心脑血管疾病具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种胆固醇酯酶及其应用，所述胆固醇酯酶由自主筛选的产酶镰刀菌（Fusariumsp.）WZ22发酵制备，此菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2016年12月14日，保藏编号为：CCTCC M 2016751。以此菌种发酵制备胆固醇酯酶粗酶。该菌株发酵产生的酶液具有良好的水解胆固醇酯的功能，在酶法测定血清总胆固醇含量的测定方面具有较高的应用价值。

该胆固醇酯粗酶经丙酮沉淀，凝胶过滤层析制得胆固醇酯酶。该酶N端序列为甲硫氨酸（Met）-异亮氨酸（Ile）-赖氨酸（Lys）-脯氨酸（Pro）-丙氨酸（Ala）-精氨酸（Arg），分子量为62KDa，pI =5.18。

该胆固醇酯酶在胆固醇酯的降解方面具有良好应用。尤其是在胆固醇与2-18个碳原子的脂肪酸形成的酯。降解过程中，降解方式选自油相降解和水油乳化包埋降解。

本发明中涉及到的酶液主要通过有氧发酵制得。其发酵培养基成分主要包括液体卵磷脂0.5%-1.0%，氯化锌0.2%-0.5%，磷酸氢二钠0.2%-0.5%，硫酸铵0.1%-0.5%，氯化钠0.5%-0.8%，七水合硫酸亚铁0.01%-0.1%。该酶液可在水相及水油两相混合状态下实现胆固醇酯的降解。在水相条件下降解，酶液与底物的添加比例为3:1-5:1，反应温度40-45℃，pH6.5，反应时间为12-18h；在水油两相混合状态下降解，酶液与底物与乳化剂的添加比例为3:1:1-5:2:1，反应温度40-45℃，pH6.5，反应时间为18-24h。

【具体实施方式】

实施例1胆固醇酯酶分离纯化