[发明专利]一种烟草抗病毒调控基因筛选方法及应用

说明书

本发明提供了一种烟草抗病毒调控基因筛选方法及应用，该方法首先以病毒诱导的基因沉默VIGS载体为目的载体，构建烟草cDNA文库，进行均一化处理后获取可直接用于基因沉默筛选分析的VIGS‑cDNA文库；将VIGS‑cDNA文库质粒转化至农杆菌，获得农杆菌文库；将农杆菌文库涂板培养获取单菌落，对每个单菌落分别进行VIGS沉默分析，筛选获得抗病毒相关菌落；对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，并对获得的序列进行同源性分析和功能预测，获取抗病毒调控基因。本发明方法操作简便，无需构建转基因植株或突变体，耗时短，筛选全面效率高，特别适用于突变致死基因的筛选，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于植物抗病调控基因筛选及应用技术领域，涉及一种烟草抗病毒调控基因筛选方法及应用。

背景技术

植物cDNA文库是指一个植物物种所有cDNA的集合。这些cDNA通常被插入一个载体，转化至大肠杆菌中混合保存。构建完成后，可供随时选取使用。另外，通过选择使用不同的文库构建载体，可以进行不同的植物功能基因组学研究。比如用植物表达载体构建的文库，可以用于植物体内瞬时过表达分析，筛选特定目标功能的调控基因。因此，植物cDNA文库的利用是植物功能基因组学研究的基本研究手段，也是规模化筛选、分离和克隆目的调控基因的主要途径之一。植物cDNA文库的构建步骤主要包括植物组织总RNA提取，mRNA纯化，反转录，连入载体，均一化处理，连接产物的细菌转化，质粒提取，PCR和酶切检验，容量和重组率分析等。

植物基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(Phenotype)或功能发挥情况来判断。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(Over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过RNA干扰(RNA interfering,RNAi)、基因敲低(Knock-down)和基因敲除(Knock-out)等方式来达到。超表达通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲低还可以通过病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)来实现。基因敲除(Knock-out)则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。对于单个基因，只要构建基因超表达植株和/或超表达植株、基因敲除突变体，比较这些植株的表型和性状与野生型/正常植株的差异，就能明确目的基因对该性状的调节功能。但对于亚组学和组学水平的规模化基因功能分析，则需要构建所有基因的超表达库、突变体库或VIGS文库方可达到筛选和分离目标基因的目的。

由于外源基因的导入，导致植物中与该外源基因一致及与之高度同源的植物内源基因的转录本积累受到抑制的现象称为转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)。“病毒诱导的基因沉默”(virus-induced gene silencing，VIGS)是植物中研究最广泛的PTGS现象。VIGS现象本来是植物抗病毒侵染的一种自然机制。但近年来，已被开发成为一项快速基因功能鉴定新技术。只需将植物目的基因片段插入病毒载体，构建成重组病毒，侵染植物后即可用于抑制与插入片段高度同源的植物内源目的基因的表达，从而探明该基因功能。经过数年的研究，该思路已发展成一项可以快速高通量研究植物基因功能的成熟技术，在植物功能基因组学的研究中正得到越来越广泛的应用。

目前已有的用于功能丧失(loss-of-function)研究的方法主要包括化学突变分析，转座子或农杆菌T-DNA插入突变分析。这些方法在拟南芥等少数模式植物基因功能研究中非常有效，但在其他植物中尚未能大规模的应用。另外，抑制目的基因表达的技术还包括反义RNA技术，RNAi技术以及化学制剂诱导性基因沉默技术。所有这些技术均需构建转基因植株。VIGS技术与现有这些技术相比，具有以下优点或特点：