[发明专利]一种烟草抗病毒调控基因筛选方法及应用

权利要求书

1.一种烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以VIGS载体为目的载体，构建烟草cDNA文库，进行均一化处理后获取可直接用于基因沉默筛选分析的VIGS-cDNA文库；

(2)cDNA文库-VIGS分析：将构建完成的VIGS-cDNA文库质粒转化至农杆菌，获得农杆菌文库，将农杆菌文库涂板培养获取单菌落，对每个单菌落分别进行VIGS沉默分析；

(3)抗病毒调控基因的筛选：对cDNA文库各菌落的VIGS沉默植株进行抗病毒分析，筛选获得抗病毒相关菌落；

(4)抗病毒调控基因的鉴定：对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，并对获得的序列进行同源性分析和功能预测，获取抗病毒调控基因。

2.如权利要求1所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，步骤(1)构建烟草cDNA文库的方法是：

1)提取烟草总RNA，获得烟草mRNA，构建DSN均一化cDNA初级文库，将均一化处理的cDNA通过BP重组反应克隆入载体，然后转化感受态细胞，通过涂板和单克隆检测，分析文库的容量和均一化效果；

2)进行VIGS次级文库的构建：提取步骤1)得到的cDNA初级文库质粒，将得到的初级文库质粒稀释后通过LR重组反应克隆入VIGS载体；通过涂板和单克隆检测，分析文库的容量和重组率；

3)鉴定获取容量大和重组率高的烟草VIGS-cDNA文库。

3.如权利要求2所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，VIGS载体为pTRVG，得到的VIGS-cDNA文库为pTRVG-cDNA文库。

4.如权利要求1所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，步骤(2)对每个单菌落分别进行VIGS沉默分析的方法为：

1)吸取部分农杆菌菌液涂板培养，同时培养转化了的农杆菌文库；挑取单菌落，接种于含抗生素的液体培养基中进行培养，收集菌体细胞，重悬至OD₆₀₀值为2，恢复培养后，按1：1(V:V)比例将转化了的农杆菌和插入目的基因片段的VIGS-cDNA文库转化菌进行混合；

2)植株的浸润接种：将混合农杆菌液浸润苗龄为20-25d的烟草上部完全伸展的叶片，以浸润转化了的农杆菌和VIGS-eGFP农杆菌的混合菌液作为对照；

3)将浸润接种后的烟草培养，让目的基因进行有效的沉默。

5.如权利要求1-4任一所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，步骤(3)的抗病毒分析方法为：沉默处理两周后，对cDNA文库各菌落的VIGS沉默植株分别进行抗病毒分析，接种烟草病毒，接种后，观察和记录病毒病害症状，获取沉默后病毒病害症状严重度发生显著改变的菌落，这些菌落对应的基因即为抗病毒调控基因的候选基因。

6.如权利要求5所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，所述病毒为马铃薯Y病毒和烟草花叶病毒。

7.如权利要求1-4任一所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法，其特征在于，步骤(4)对筛选获得的抗病毒相关菌落对应的基因进行测序分析，获取这些基因的序列，并对这些序列进行烟草和其它植物基因组数据库的BLAST分析、保守结构域分析，预测基因功能，从而获取抗病毒调控基因。

8.权利要求1-7任一所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法在烟草病毒病防治中的应用。

9.权利要求1-7任一所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法在制备抗病毒转基因烟草中的应用。

10.权利要求1-7任一所述的烟草抗病毒调控基因筛选方法在获取烟草抗病毒调控基因并用于烟草种质资源改良中的应用。