[发明专利]用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法

说明书

本发明涉及线粒体DNA分子检测领域，特别涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对，引物对的正向引物位于线粒体重链复制原点的正负300bp范围内，反向引物位于线粒体重链复制原点区段内。本发明巧妙地将长程PCR的两条引物均设计在人类线粒体DNA的重链复制原点邻近区域，避免了因为引物落入删除区域而导致漏检的问题；本发明的扩增区域长达16397bp，几乎扩增整个环形线粒体DNA，可覆盖环形线粒体DNA上几乎所有可能的删除类型，形成了一种检测范围广、灵敏度高、操作快速简单、成本低廉的人类线粒体DNA删除突变及耗竭的检测方法。

技术领域

本发明涉及线粒体DNA分子检测领域，具体而言，涉及用于检测人类线粒体DNA删除突变及耗竭的引物对、试剂盒及其方法。

背景技术

线粒体是细胞内一种提供能量的细胞器，在人体除了成熟的红细胞以外，其他所有的细胞都含有数量不等的线粒体。线粒体是双膜结构，有独立的可以半自主复制的遗传物质即线粒体DNA。在线粒体内可完成多种生物化学反应，主要是氧化磷酸化过程。氧化磷酸化是将丙酮酸和脂肪酸等底物氧化成水和二氧化碳的过程，在此过程中产生的三磷酸腺苷(ATP)为细胞活动提供能量。

线粒体功能受损，可导致氧化磷酸化过程中ATP产生缺陷，从而引起细胞代谢紊乱并出现一系列的临床症状。骨骼肌和神经系统中由于存在大量线粒体，耐缺氧能力较差，因此对ATP供应不足最敏感，成为发病率最高的器官。临床上表现为LHON综合征(Leber遗传性视神经病)；MERRF 综合征(肌阵挛性癫痫发作、小脑共济失调、乳酸血症和碎红肌纤维)；MELAS综合症(线粒体肌病、脑病、乳酸中毒、卒中样发作)；Leigh病(亚急性坏死性脑脊髓病)；KSS综合征(视网膜色素变性、心脏传导阻滞和眼外肌麻痹)；Pearson综合征(骨髓-胰腺综合征)；CPEO综合症(慢性进展性眼外肌麻痹)；Alpers病(家族性原发性进行性灰质萎缩症)；MNGIE综合征 (线粒体周围神经病并胃肠型脑病)；NARP综合征(视网膜色素变性共济失调性周围神经病)；Menke病(卷毛型灰质营养不良)；wolfram综合征(视神经萎缩、耳聋、糖尿病)；线粒体心肌病等。另外，线粒体功能受损还与其他一些疾病如帕金森病、肿瘤、冠心病等相关。

虽然人类线粒体自身基因组只编码13种蛋白质，约相当于线粒体生命活动总蛋白质的1％不到，但目前已知的线粒体疾病绝大多数来源于线粒体基因编码蛋白质的缺失或缺陷。线粒体DNA(线粒体DNA)是独立于细胞核染色体外的又一基因组，虽然它仅由16569个碱基组成，但其表达对于维持细胞的生理功能至关重要。与核DNA相比，线粒体DNA更易于发生突变。核DNA具有完善的突变纠正机制，但线粒体只有有限的DNA修复机制(如线粒体DNA聚合酶无校对功能,不能像核基因那样去除变异的碱基)；机体95％以上的氧自由基来自于线粒体，线粒体呼吸链产生的氧自由基积累会导致线粒体DNA的损伤和突变；线粒体DNA缺乏组蛋白保护；线粒体DNA没有内含子，突变易损害重要的功能区。这些因素使得线粒体DNA的突变率非常高，从而导致线粒体病。至今已发现几百种线粒体DNA 异常，这些发现很大程度上丰富了我们对线粒体病的认识。