[发明专利]基于微量法的1;3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种基于微量法的1,3‑二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法，该试剂盒的试剂包括由Tris‑HCl，EGTA，巯基乙醇，甘油混合而成的提取液，由MgSO₄.7H₂O，NADH，ATP，三磷酸甘油醛脱氢酶混合而成的试剂一，由Tris‑HCl组成的试剂二；该方法的原理为3磷酸甘油醛脱氢酶可逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH生成3磷酸甘油醛、无机磷和NAD，在反应体系中加入3磷酸甘油醛脱氢酶和NADH，340nm处测定NADH的减少量可反映1，3二磷酸甘油酸含量的高低。本发明具有适用范围广，操作简便，检测时间短，检测灵敏度高，成本低廉，重复性好，准确率高等特点。

技术领域

本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法。

背景技术

1，3二磷酸甘油酸是糖酵解过程的中间代谢产物，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

目前现有的检测1,3二磷酸甘油酸含量的方法为双抗体一步夹心酶联免疫吸附法（ELISA)，但是该方法存在检测周期长，成本高，适用范围窄，稳定性差，准确度低和假阳性等缺点，这导致目前市面上还没有一种有效的利用生化法检测1,3二磷酸甘油酸含量的试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法，具有适用范围广，操作简便，检测时间短，检测灵敏度高，成本低廉，重复性好，准确率高等特点。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：

提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl，EGTA，巯基乙醇，甘油混合而成，至于100mL容量瓶中，4℃保存；

试剂一，粉剂×1瓶，由半胱氨酸，MgSO₄.7H₂O，NADH，ATP，三磷酸甘油醛脱氢酶混合而成，置于30mL试剂瓶中，-20℃保存；

试剂二，液体20mL×1瓶，由Tris-HCl组成，置于20mL容量瓶中，4℃保存。

进一步的，所述提取液中含有的具体组分为100mL 100mM pH8.2 Tris-HCl，38mgEGTA，50μL巯基乙醇和5mL甘油。

进一步的，所述试剂一中含有的具体组分为8.4mg半胱氨酸，8.4mg MgSO₄.7H₂O，2.4mg NADH，7.2mg ATP和0.5mg三磷酸甘油醛脱氢酶。

进一步的，所述试剂二中含有的具体组分为84mM pH7.6 Tris-HCl。

一种采用上述试剂盒的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备分光光度计或酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；

步骤2 1，3二磷酸甘油酸的提取；

动植物组织：称取0.1g样本，加入1mL所述提取液，冰浴匀浆，然后设置离心率为8000g，4℃下离心10min，取上清测定；

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为（500~1000）：1的比例，超声波破碎细菌或细胞；最后设置离心率为8000g，在4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；