[发明专利]基于微量法的1;3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl，EGTA，巯基乙醇，甘油混合而成，至于100mL容量瓶中，4℃保存；

试剂一，粉剂×1瓶，由半胱氨酸，MgSO₄.7H₂O，NADH，ATP，三磷酸甘油醛脱氢酶混合而成，置于30mL试剂瓶中，-20℃保存；

试剂二，液体20mL×1瓶，由Tris-HCl组成，置于20mL容量瓶中，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述提取液中含有的具体组分为100mL 100mM pH8.2 Tris-HCl，38mg EGTA，50μL巯基乙醇和5mL甘油。

3.根据权利要求1所述的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂一中含有的具体组分为8.4mg半胱氨酸，8.4mg MgSO₄.7H₂O，2.4mg NADH，7.2mgATP和0.5mg三磷酸甘油醛脱氢酶。

4.根据权利要求1所述的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，其特征在于：所述试剂二中含有的具体组分为84mM pH7.6 Tris-HCl。

5.利用如权利要求1所述的试剂盒的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备分光光度计或酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；

步骤2 1，3二磷酸甘油酸的提取；

动植物组织：称取0.1g样本，加入1mL所述提取液，冰浴匀浆，然后设置离心率为8000g，4℃下离心10min，取上清测定；

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为（500~1000）：1的比例，超声波破碎细菌或细胞；最后设置离心率为8000g，在4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3 仪器的预热和调节；

分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；

步骤4 1，3二磷酸甘油酸含量的测定操作；

工作液的配制：将所述试剂二全部倒入所述试剂一的试剂瓶中，充分溶解，预热10分钟；

在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL制备好的所述工作液，混匀，记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2；

步骤5 1，3二磷酸甘油酸含量的计算；

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1）按样本蛋白浓度计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol/mg prot）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（V_样×Cpr）÷T=643×ΔA÷Cpr；

2）按样本鲜重计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V样÷V_样总）÷T=643×ΔA÷W；

3）按细菌或细胞密度计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol /10⁴ cell）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V_样÷V_样总）÷T=1.286×ΔA；

其中，V_反总=2×10^-4L，表示反应体系总体积；

ε=6.22×10³ L/mol/cm，表示NADH摩尔消光系数；

d=1cm，表示比色皿光径；

V_样=0.01mL，表示加入样本的体积；

V_样总=1mL，表示加入提取液的体积；

T=5min，表示反应时间；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示500万个细菌或细胞总数；

b.用96孔板测定的计算公式如下：

1）按样本蛋白浓度计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol/mg prot）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（V_样×Cpr）÷T=1286×ΔA÷Cpr；

2）按样本鲜重计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V_样÷V_样总）÷T=1286×ΔA÷W；

3）按细菌或细胞密度计算；

1，3二磷酸甘油酸（nmol/10⁴ cell）=[ΔA×V_反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V_样÷V_样总）÷T=2.573×ΔA；

其中，V_反总=2×10^-4L，表示反应体系总体积；

ε=6.22×10³ L/mol/cm，表示NADH摩尔消光系数；

d=0.5cm，表示96孔板光径；

V_样=0.01mL，表示加入样本的体积；

V_样总=1mL，表示加入提取液的体积；

T=5min，表示反应时间；

Cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/mL；

W表示样本质量，单位为g；

500表示500万个细菌或细胞总数。