[发明专利]一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用

说明书

本发明公开了一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3‑丙二醇中的应用，具体涉及一种过表达发酵乳杆菌甘油通道蛋白基因glpF的重组克雷伯氏杆菌在生产1，3‑丙二醇的应用，属于基因工程领域。本发明应用基因工程方法，将带有发酵乳杆菌中glpF基因的过表达载体转入到克雷伯氏杆菌中，从而提高其对甘油的转运能力，提高克雷伯氏杆菌中1，3‑丙二醇的产量。重组菌经5L发酵罐补料分批发酵，1，3‑丙二醇产量高达76g/L。此发明成功改变了克雷伯氏杆菌中对甘油的转运能力，为选育1，3‑丙二醇高产菌株提供了崭新的思路。

技术领域

本发明涉及一种重组克雷伯氏杆菌在制备1，3-丙二醇中的应用，具体涉及在克雷伯氏杆菌中异源表达发酵乳杆菌甘油通道蛋白基因glpF以提高1，3-丙二醇产量的方法和应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

1，3-丙二醇(1，3-PDO)是国际上公认的六大石化新产品之一，在纺织、塑料及食品包装等方面具有广阔的应用前景，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体，它和对苯二甲酸聚合而成的聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)是合成新型优质聚酯材料的前体物质。

1，3-丙二醇的生产方法有化学合成法和生物转化法。生物转化法生产1，3-丙二醇具有合成工艺相对简单，反应条件较温和，不产生有毒中间物，生产过程更为环保的优点，已成为当前的研究热点。用于生产1，3-丙二醇的菌株均为细菌，主要有克雷伯氏杆菌、弗氏柠檬菌、成团肠杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、丁酸梭状芽孢杆菌和巴斯德梭菌等，它们只能利用甘油而不能由糖类等廉价碳源直接产生1，3-丙二醇。其中克雷伯氏杆菌具有相对较高的底物转化率和生产强度，因而得到了较多关注。

然而，用微生物生产大宗化学品如生物燃料的一个主要挑战是生产目的产物通常对细胞有毒。已知许多短链醇通过损伤细胞膜来降低细胞活力和干扰必要的生理过程。因此，细胞必须权衡生产和生存，降低目的产物潜在产量。

1，3-丙二醇在克雷伯氏杆菌中合成，是生长偶联的代谢产物，当克雷伯氏杆菌利用甘油作为碳源生产1，3-丙二醇时，存在产量较低，转化率较低等缺点，且在克雷伯氏杆菌发酵生产时随着1，3-丙二醇的积累会抑制底物的转运。而目前，对克雷伯氏杆菌的改造提高1，3-丙二醇的生产研究，主要集中在代谢途径和还原力的再生这两个方面，但是已有的改造方式并不能改善底物的转运效率。因此，提供一种产量和转化率较高、能够改善底物转运效率的生产1，3-丙二醇的方法，对于1，3-丙二醇的生产应用具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种重组克雷伯氏杆菌，其特征在于，是将来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的甘油通道蛋白基因glpF连接到过表达载体上，将连接产物转入克雷伯氏杆菌(Klebsiella Peneumoniae)中得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述甘油通道蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述甘油通道蛋白基因glpF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达载体是在pET-28a载体中引入了序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达载体的构建方法为：用EcoRI和BamHI双酶切pET28a和序列如SEQ ID NO.3所示的tac启动子，酶切后，PCR连接得到过表达载体pEtac-28a(+)。

本发明的第二个目的是提供一种上述的重组克雷伯氏杆菌的构建方法，所述方法包括：

(1)从发酵乳杆菌基因组中克隆甘油通道蛋白基因glpF，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

(2)将glpF基因与上述的过表达载体pEtac-28a相连，并将连接产物转化到克雷伯氏杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述转化采用的是电击转化法。