[发明专利]一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法

说明书

本发明公开了一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，通过将卵母细胞在含有褪黑素的冷冻液中冷冻，后经含有褪黑素的蔗糖溶液解冻后培养，再经卵母细胞孤雌激活，最后进行孤雌激活胚胎体外培养完成。本发明方法工艺简单、耗时短，且能有效提高玻璃化冷冻后成熟卵母细胞孤雌激活发育潜力。

技术领域

本发明涉及动物繁殖技术领域，具体涉及一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法。

背景技术

卵母细胞超低温冷冻保存是一项非常重要的辅助生殖技术，在生物科学，农业和医学领域都非常有应用价值。小鼠、牛、人、兔卵母细胞，经玻璃化冷冻保存，体外受精后能继续发育，胚胎移植后均产生健康后代。然而，冻融卵母细胞体外受精后的囊胚发育率或后代出生率还不理想。小鼠生发泡(Germinal Vesicle,GV)期卵母细胞进行玻璃化冷冻，解冻后体外受精(in vitro fertilization,IVF)囊胚率为20-42.9％；而小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻后其IVF囊胚率为33％，牛成熟卵母细胞冻融后体外受精的囊胚率13-25.5％，兔卵母细胞玻璃化冷冻保存后，体外受精的胚胎移植后获得了5.5％的后代出生率。由此可见，卵母细胞冻融后较低的发育潜力还难以满足商业化生产的需求。玻璃化冷冻引起的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量上升以及发育过程中基因表达的变化仍然是其发育潜力低下的重要原因。

褪黑素，主要在脊椎动物松果体腺中产生，是一种多功能分子。褪黑素及其代谢产物是强力的自由基清除剂和抗氧化剂，可以直接清除ROS，刺激抗氧化酶，增加谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平，并抑制细胞和组织的促氧化酶，促进抗凋亡基因Bcl-xl的表达。褪黑素能降低脂质过氧化反应并提高了精子DNA完整性，也能保护排卵时卵母细胞免受自由基损伤并提高卵母细胞细胞核和细胞质成熟；褪黑素也能提高体外受精率，促进胚胎发育至囊胚和孵化囊胚，增加囊胚细胞数。小鼠2-细胞胚胎经历玻璃化冷冻和解冻后，在胚胎培养液中添加10^-9mol/L褪黑素能增加胞内GSH水平并降低ROS生成，进而减少了囊胚凋亡率及凋亡细胞计数。我们以前的试验结果表明：小鼠MII期卵母细胞超低温冷冻解冻后在M2中添加不同浓度(10^-9、10^-7、10^-5、10^-3mol/L)褪黑素培养1小时，卵母细胞孤雌激活后的发育能力没有提高。而多项研究表明在鼠、牛、猪、羊和斑马鱼等动物冷冻卵母细胞和胚胎体外培养液中添加适当浓度的褪黑素可以促进胚胎发育能力，但是在玻璃化冷冻解冻液、解冻后体外培养液、孤雌激活液和体外培养液中均添加褪黑素对卵母细胞发育潜力的影响鲜见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌激活发育潜力的方法，用于生产应用。具有工艺简单，耗时短的特点。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，包括以下步骤：

1)卵母细胞收集：采集7-8周龄雌性小鼠输卵管，脱去颗粒细胞，洗涤后待用；

2)卵母细胞冷冻：采用OPS法玻璃化冷冻，将卵母细胞在预处理液中处理30秒，然后转移至冷冻液中处理25秒后，迅速将装载有卵母细胞的OPS管投入到液氮中；

3)卵母细胞解冻：OPS管从液氮中取出立即浸入37.5℃恒温的蔗糖溶液中，将卵母细胞吹出至蔗糖溶液大液滴中，洗涤后转移至蔗糖溶液小液滴中，此过程共计5分钟。洗涤后转移至预先在培养箱中孵育约8小时的M₂(卵母细胞、胚胎操作液，用于临时存放或洗涤的液体)中，并于培养箱中培养1小时；

4)卵母细胞孤雌激活：体外培养1小时后将卵母细胞在孤雌激活A液中转洗3次后放在A液中，于培养箱中培养2.5小时，然后将细胞转至孤雌激活B液中转洗3次后放在B液中，于培养箱中培养3.5小时；