[发明专利]一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法

权利要求书

1.一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)卵母细胞收集：采集7-8周龄雌性小鼠输卵管，脱去颗粒细胞，洗涤后待用；

2)卵母细胞玻璃化冷冻：卵母细胞在预处理液中处理30秒，然后转移至冷冻液中处理25秒，迅速将装载有卵母细胞的开放式拉长塑料细管(Open Pulled Straw,OPS)投入到液氮；

3)卵母细胞解冻：OPS管从液氮中取出，立即浸入37.5℃恒温的蔗糖溶液中，然后将卵母细胞吹出至蔗糖溶液大液滴中，洗涤后转移至蔗糖溶液小液滴中，此过程共计5分钟。然后转移至预先在培养箱中孵育约8小时的M₂中，置于培养箱中培养1小时；

4)卵母细胞孤雌激活：体外培养1小时后，成熟卵母细胞在孤雌激活A液中洗涤3次，后转入另一A液中，并在培养箱中培养2.5小时，然后将细胞转至孤雌激活B液中，洗涤3次后置入另一B液中，于培养箱中培养3.5小时；

5)孤雌激活胚胎体外培养：将孤雌激活后的卵母细胞转入胚胎培养液中培养。

2.根据权利要求1所述的一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的预处理液为10％EG(ethylene glycol)+10％DMSO(Dimethylsulfoxide)，其中含有褪黑素，其浓度为10^-9mol/L；所述的冷冻液选自含褪黑素浓度为10^-9mol/L的EDFS30(EG和DMSO以DPBS为溶剂稀释成10％(v/v)EG+10％(v/v)DMSO；含有30％(w/v)Ficoll和0.5mol/L蔗糖的冷冻液称为FS液，EG、DMSO和FS液按体积比为1.5:1.5:7混合后即得EDFS30)。

3.根据权利要求1所述的一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，步骤(2)中蔗糖溶液的浓度为0.5mol/L，所述的蔗糖溶液和M₂液中均含有10^-9mol/L的褪黑素。

4.根据权利要求1所述的一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，步骤(2)中培养箱培养条件为：5％CO₂，37.5℃，100％湿度。

5.根据权利要求1所述的一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，步骤(4)中孤雌激活A液为：890μL HTF+100μL SrCl₂+10μL细胞松弛素D(Cytochalasin D,CD)，且含10^-9mol/L的褪黑素；孤雌激活B液为：990μL HTF+10μL CD，且含10^-9mol/L褪黑素。

6.根据权利要求1所述的一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法，其特征在于，步骤(5)中胚胎培养液为添加10^-9mol/L褪黑素的KSOM。