[发明专利]一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体的方法

说明书

本发明属于甾醇生物转化技术领域，具体涉及一种混菌发酵生物转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α‑羟基‑雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的方法。本发明将分枝杆菌TCCC 11028 M3接入含有植物甾醇和转化介质环糊精的发酵培养基中，培养24h后接种赭曲霉CICC 41473孢子液继续进行转化。本发明利用混菌发酵实现了由植物甾醇到11α‑羟基‑雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的一步转化。此方法提高了产物的生成率，缩短了转化周期，简化操作，节约成本，适用于甾体化合物生物转化的生产。

技术领域：

本发明属于甾醇生物转化技术领域，具体涉及一种混菌发酵生物转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。

背景技术：

甾体化合物是含有四个环戊烷多氢菲的萜类化合物，广泛存在于动植物组织和一些微生物细胞中。以甾体化合物为原料生产的甾体药物对机体起着非常重要的调节作用，其被广泛地用于疾病治疗和健康保健。目前，甾体药物的市场需求仅次于抗生素，如醛固酮拮抗剂、依普利酮已临床治疗心衰、高血压、水肿、肝腹水、呼吸衰竭等多种疾病。11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮(11α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，11α-OH AD)是哺乳动物中主要的肾上腺甾体，并且是合成卤化皮质激素(天然皮质类固醇有药学价值的类似物)的关键前体。已经发现多种微生物可以利用雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)羟基化为11α-OH AD，主要为一些真菌菌种包括赭曲霉、雅致小克银汉霉、黑根霉、球孢白僵菌、金龟子绿僵菌等。

长期以来，甾体化合物生产中主要原材料是天然薯蓣皂素。然而，将天然薯蓣皂素通过化学方法转化为有价值的甾体有很多缺点，比如成本高，步骤复杂，产量低，土地资源及野生植物资源浪费等。近年来，甾体生产主要集中于对天然薯蓣皂素的替代物植物甾醇(谷甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，菜油甾醇)的微生物转化。来自农业，食品，纤维素制造业的废弃物植物甾醇不需纯化直接可以用于生产有价值的甾体化合物。分枝杆菌、红球菌、米曲霉、串珠镰刀菌等可以转化植物甾醇生产AD，其中分枝杆菌属及红球菌属是最有效生产AD的微生物。

在工业生产中，以植物甾醇为原料生产11α-OH AD需要经过两步微生物转化反应。第一步，分枝杆菌侧链降解植物甾醇生成AD；第二步，利用具有11α羟化能力的菌株将AD羟基化得到11α-OH AD。在实际操作中，如对每步反应的产物进行提取、分离就造成大量的人力、物力和时间的浪费。如果把上述提及的两步微生物转化反应一步完成，会使整个工艺过程简化，同时节约了大量用于提取、分离操作的有机溶剂，降低了生产成本。而混菌发酵在技术上也存在一定的难度，主要是由于不同菌种的生长和发酵条件存在很大差异，如温度、培养基、pH等方面很难在同一发酵条件下使得两种菌各自发挥最大的酶活力。因此，寻找一组合适的微生物组合及发酵方法能够实现从植物甾醇到11α-OH AD的一步转化十分重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种缩短发酵周期、节约成本并且提高产物生成率的混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法。

本发明采用的生产菌株为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)。

应用上述微生物转化植物甾醇生产11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其步骤如下：

(1)在含有2-30g/L的植物甾醇的发酵培养基中，按3-14％接种量接入分枝杆菌种子培养液，25℃-32℃，150-220r/min，培养24h；

(2)将赭曲霉孢子悬浮液以孢子终浓度为0.5-2×10⁶个/mL的接种量接入步骤(1)获得的培养液中，培养温度为25℃-32℃，150-220r/min的转速下转化4-7d；

优选地，当植物甾醇浓度为2-7g/L时，转化4-5d，产物生成率达到79-87.3％；