[发明专利]一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体的方法

权利要求书

1.一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）在含有2-30 g/L的植物甾醇的发酵培养基中，按3-14%接种量接入分枝杆菌种子培养液，25℃-32℃，150-220 r/min，培养24 h；

（2）将赭曲霉孢子悬浮液以孢子终浓度为0.5×10⁶-2×10⁶个/mL的接种量接入步骤（1）获得的培养液中，培养温度为25℃-32℃，150-220 r/min的转速下转化4-7d；

所述赭曲霉为赭曲霉（A.ochraceus）CICC 41473；

所述分枝杆菌为分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）TCCC 11028 M3（MNR M3）；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 25-45 g/L，柠檬酸 2-10 g/L，柠檬酸铁铵 0.05-0.5g/L，硫酸镁 0.5-2 g/L，磷酸氢二钾 0.5-2 g/L，磷酸氢二铵 3.5-10 g/L，玉米浆 30-60g/L，蚕蛹粉 2-10 g/L，环糊精10-100 g/L，其余为水，pH 6.5-7.0。

2.如权利要求1所述的一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述分枝杆菌种子培养液的培养方法如下：使用0.5%的Tween 80无菌水溶液洗下斜面种子，使菌体OD₆₀₀值控制在1.0±0.2，以3-15%的接种量接种到种子培养基中，28℃，200 r/min，36-48 h培养至对数生长期。

3.如权利要求2所述的一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为: 磷酸氢二钾0.5 g/L，硫酸镁0.5 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L，柠檬酸2 g/L，硝酸铵 2 g/L，丙三醇 20 g/L，葡萄糖10 g/L，碳酸钙 10 g/L，其余为水，pH自然，115 ℃高压蒸汽下灭菌20 min。

4.如权利要求1所述的一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，所述赭曲霉孢子悬浮液的制备方法如下：采用无菌水将斜面上的菌体洗下，并将含孢子的悬浮液倒入灭过菌的上面附有3层纱布并盛有玻璃珠的三角瓶中，进行充分震荡，配成一定浓度的孢子悬浮液。

5.如权利要求1所述的一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，植物甾醇浓度为2-7g/L时，转化时间为4-5d。

6.如权利要求1所述的一种混菌发酵转化植物甾醇制备甾体药物中间体11α-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）在含有3 g/L的植物甾醇的发酵培养基中，按8%接种量接入分枝杆菌种子培养液，28℃，200 r/min，培养24 h；

（2）将赭曲霉孢子悬浮液以孢子终浓度为10⁶个/mL的接种量接入步骤（1）获得的培养液中，培养温度为28℃，200 r/min的转速下转化5d；

所述的发酵培养基的组成为: 葡萄糖 30 g/L，柠檬酸2 g/L，柠檬酸铁铵0.05 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，磷酸氢二铵3.5 g/L，玉米浆 40 g/L，蚕蛹粉 2 g/L ，环糊精 38 g/L，其余为水，pH 6.5-7.0，121 ℃高压蒸汽下灭菌20 min。