[发明专利]用于EB病毒DNA检测的引物和crRNA及其应用

说明书

本发明公开了用于检测EB病毒(Epstein‑Barr virus)DNA的一种特异性引物和一种特异性靶向检测EB病毒的crRNA，以及对鼻咽癌患者进行EB病毒DNA检测的方法。采用本发明方法可在不依赖实时荧光定量PCR(qPCR)仪等复杂仪器情况下检测EB病毒DNA，获得的结果与qPCR法检测结果基本一致，临床血浆样检测灵敏度96％，特异度100％。

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断领域，具体涉及与肿瘤诊断相关的分子检测，更具体涉及一种EB 病毒DNA的特异性检测引物和一种靶向EB病毒的特异性crRNA，以及利用该引物和crRNA 对鼻咽癌患者进行EB病毒DNA的定量检测方法。

背景技术

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是发生于鼻咽腔顶部和侧壁黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。在中国华南地区鼻咽癌是常见的恶性肿瘤，其发生率高达20/100000，故亦称广东癌，在所有恶性肿瘤发病率中排名前十。

临床研究显示血浆EB病毒DNA水平是鼻咽癌的独立生物标志物。Mutirangura等首次发现能从鼻咽癌患者血浆中检测到EB病毒DNA(Clinical Cancer Research,1998)。在此研究基础上，卢煜明院士利用实时荧光定量PCR技术分别检测鼻咽癌患者和健康人血浆中的EB 病毒DNA，发现鼻咽癌患者血浆中EB病毒DNA阳性率显著高于健康人，血浆中EB病毒DNA含量可作为鼻咽癌筛查方法(Cancer Research,1999)。曾木圣课题组通过利用实时荧光定量PCR技术检测鼻咽癌患者血浆中EB病毒DNA含量，可对鼻咽癌患者进行分期(Journalof the National Cancer Institute，2015)。

然而，实时荧光定量PCR技术所需要的仪器较为复杂，难以在偏远地区进行推广。RPA，即重组酶聚合酶扩增技术，主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶进行等温核酸扩增，是一种可以替代传统PCR的新型核酸检测技术。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于EB病毒DNA检测的特异性引物和特异性crRNA，以及利用该引物和crRNA对鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA的早期快速定量检测方法，该方法具有不依赖qPCR仪等复杂仪器等特点。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于检测EB病毒DNA的引物对，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种用于检测EB病毒DNA的crRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种检测EB病毒DNA的试剂盒，其特征在于：包含上述所述的引物对和crRNA。

进一步的，上述试剂盒中还含有LwCas13a蛋白和底物报告RNA RNase alert v2。

进一步的，上述试剂盒中还含有RNA酶抑制剂，ATP，GTP，UTP，CTP，T7聚合酶，MgCl₂和MgAc。

一种检测EB病毒DNA的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品DNA，得模板；

2)将所得模板DNA在反应体系进行相应的反应程序，先利用重组酶聚合酶扩增技术和上述所述引物对在25～37℃条件下对模板DNA进行扩增反应，然后在25～37℃条件下对扩增产物进行转录反应得到转录产物RNA，使用上述所述的crRNA、LwCas13a在25～37℃条件下对转录产物进行荧光信号检测；上述所有扩增反应和转录反应均的同一反应体系中进行或分开在不同体系中进行；

3)根据荧光信号值对待测样品中EB病毒DNA进行定量。

进一步的，上述同一反应体系为每100μL反应体系中包括：