[发明专利]用于EB病毒DNA检测的引物和crRNA及其应用

权利要求书

1.一种用于检测EB病毒DNA的引物对和crRNA，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。

2.一种检测EB病毒DNA的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物对和crRNA。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有LwCas13a蛋白和RNA底物报告物，所述RNA底物报告物为RNase Alert v2。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中还含有RNA酶抑制剂，ATP，GTP，UTP，CTP，T7 聚合酶，MgCl₂和MgAc₂。

5.权利要求1所述的引物对和crRNA在制备检测EB病毒DNA的试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

1）提取待测样品DNA，得模板；

2）将所得模板DNA在反应体系进行相应的反应程序，先利用重组酶聚合酶扩增技术和权利要求1中所述的引物对在25～37℃条件下对模板DNA进行扩增反应，然后在25～37℃条件下对扩增产物进行转录反应得到转录产物RNA，使用权利要求1中所述的crRNA和LwCas13a在25～37℃条件下对转录产物进行荧光信号检测；上述所有扩增反应和转录反应均的同一反应体系中进行或分开在不同体系中进行；

3）根据荧光信号值对待测样品中EB病毒DNA进行定量。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述同一反应体系为每100μL 反应体系中包括：

0.48μM SEQ ID NO: 1所示正向引物

0.48μM SEQ ID NO: 2所示反向引物

1× RPA再水合缓冲液

模板DNA

45nM LwCas13a蛋白

22.5nM SEQ ID NO: 3所示crRNA

125nM RNA底物报告物

2.5μL鼠RNA酶抑制剂

2mM ATP

2mM GTP

2mM UTP

2mM CTP

1μL T7 聚合酶混合物

5mM MgCl₂

14mM MgAc₂；

所述RNA底物报告物为RNase Alert v2。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤2）中，所述荧光信号检测的程序为：在荧光读板仪中于25～37℃条件下反应2~3 h，每4~6分钟测量一次荧光信号。