[发明专利]生产抗体片段的方法

说明书

一种生产目标抗原抗体片段的方法，包括：至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予软骨鱼；从软骨鱼采集血液样本；从血液样本从提取RNA；对所述RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地扩增cDNA以获得扩增的cDNA的混合物，然后进行纯化。也公开了从鲨鱼生产抗体片段的方法；从该方法获得抗体片段；和包括该抗体片段的试剂盒。

技术领域

本申请涉及生产抗体片段的方法，特别但不排他地，涉及目标抗原从重链抗体为目标抗原生产抗体片段的方法。生产的该抗体片段可在生物医药领域或药物研发中应用。

背景技术

单克隆抗体(mAbs)广泛使用于生物技术和生物医药方面，从免疫诊断学中的目标蛋白的亲和纯化到疾病治疗。mAbs具有五种免疫球蛋白类，尺寸是150kDa。它们主要的结构由两个同一的重链(VH)和两个轻链(VL)组成。mAbs是单特异性抗体，和由几种不同的免疫细胞制成的多克隆抗体相反，mAbs由同一免疫细胞制成，即是由唯一母细胞的所有克隆体制成。但是，常规抗体的高成本和低稳定性限制了该抗体在药物开发或诊断学中的应用。

1993年，Hamers-Casterman偶然想到来源于骆驼的重链抗体，该抗体不具有轻链抗体(HCAbs)。1995年，发现了软骨鱼的免疫球蛋白新抗原受体，也称为IgNAR，其结构和功能与HCAbs相似。重链抗体仅由两种重链组成，尽管仅具有可变的重链域，其也能连接抗原。最近，已经开发出了单域抗体(sdAb，也称为纳米抗体)。sdAb是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb来源于骆驼科HcAbs的VHH片段和软骨鱼IgNAR的VNAR片段。

和常规抗体相比，sdAb是具有高稳定性、高特异性、高溶解性和隐蔽表位识别性的最小的抗体。它们在多种诊断和药物应用中具有潜在用途。将荧光蛋白融合到sdAb生成所谓的荧光蛋白基因质粒(chromobody)，其具有增加的荧光和改善的光谱特性。Chromobody可以用于识别和跟踪在活体细胞中的不同区室的目标。因此，他们能增加使用活细胞显微术的可能性并且有助于新功能的研究。在诊断生物探针应用中，预期sdAb能用作工具。由于它们的尺寸小，它们能在生物探针表面更密集地耦合。除了它们在指向不容易接近的表位上的优势，它们的构象稳定性也使得其具有更高的抵抗力来应对表面再生的情况。当前，一些从骆驼获得的sdAb已经进入治疗人类疾病的临床试验。但是，由于养育骆驼的成本很高，这极大地阻碍了sdAb的开发。

因为单克隆抗体有大的复合结构并且需要特定的转译后糖基化，现时还未能成功地通过简单微生物宿主生产。因此，它们必须要在哺乳动物细胞系中生产，其培养过程复杂并且成本高(由于介质昂贵、发酵时间长、结垢问题、使用气体等)。得到的抗体利用酶联免疫吸附测定(ELISAs)进行筛选以得到期望的特异性。但是，基于ELISA的筛选的生产量低，因为在mAb生产的初步阶段期间，只有有限的杂交瘤上清液的数量(～100μl)能用于筛选并且这通常仅足够对仅一个或两个抗原测试mAb。虽然如今mAbs在温和的条件下很好地生产和纯化，但是它们仍然容易受到聚集、脱氨和氧化影响。

通过使用能在微生物宿主(例如，Fab区域、可变域或sdAb)中生成的抗体的特殊部分，能减少与尺寸相关的对抗体的限制。受进化驱动的工程技术的强大高生产量技术是分子展示技术(molecular display):生成大的(多)肽库并且随后用于筛选具有期望的生物和物理化学性质的变体。最常用的展示技术是噬菌体展示技术(phage display)。因丝状噬菌体的粘性，经常需要利用严苛条件(例如，具有洗涤剂的缓冲剂)进行几次集中清洗步骤，称为“生物淘洗”的艰难过程，以移除非特异性噬菌体。

因此，仍强烈需要能有效降低成本的方法来高效地生产sdAb，且提供生产抗体的多样性。

发明内容