[发明专利]一种引物组的设计方法及其应用

说明书

本发明提供了一种引物组的设计方法及其应用，通过根据扩增长度的需要，巧妙地在抗体FR1起始位点的上游，提取FR1起始位点前的序列，并从5’端的第一个碱基开始，依次移位切取固定长度的引物序列，形成候选引物库，聚类分析后筛选得到免疫组库的引物组，采用该方法得到的引物组能够显著提高多重PCR法免疫组库扩增的覆盖度和实验效率，降低扩增错配率，方法简便，节省成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种引物组的设计方法及其应用，尤其涉及一种免疫组库的引物组的设计方法及其应用。

背景技术

免疫组库(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定时间内，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的多态性总和。人体负责保卫机体的免疫细胞主要有T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突细胞等。T、B细胞是人体主要的淋巴细胞，分别负责细胞免疫和体液免疫，其中，B细胞约占外周淋巴细胞总数的20％。BCR是由两条重链和两条轻链连接而成的，其中重链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区及胞质区；轻链则只有V区和C区。其中，V区由VH和VL两个结构域组成，各由三个互补决定区(CDR)组成，分别为CDR1、CDR2和CDR3，此三个CDR区共同参与抗体对抗原的识别，共同决定BCR、TCR的抗原特异性。个体中CDR区的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，在同一个体内，CDR区多样性可达10⁹-10¹²，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能。目前新兴的免疫组库研究重点就集中在研究CDR基因的多样性上。因此，需要进行免疫组库的扩增。

目前，免疫组库扩增方法主要有：5’-RACE法、多重PCR方法、唯一分子标识符(unique molecular identifiers，简称UID)法等。

5’-RACE法即5'末端的快速扩增法，该法用特异性引物进行逆转录后，在cDNA的一链5'末端加入接头，进行二次无偏移的PCR扩增，并通过亲和素磁珠富集，获得含目标区域的序列。该方法扩增引物只需要基因特异性引物如BCR/TCR的C区保守区引物，可以减少多重PCR偏差，但是，该法只能用于扩增RNA并且要分选出所要研究的特定类型的细胞；实验较普通多重PCR复杂，且有基因转录本长度和GC含量的偏好性。该方法使用的引物仅仅设计在C区一端，由于是快速扩增，所以产物长度范围较大。5'RACE法，可实现不同克隆等效扩增，单一克隆数高达10⁵，可从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’末端，扩增区域CDR。可以最大程度的避免PCR扩增的偏向性。该方法具有操作繁琐，实验样本打断会丢失部分序列，重复性较差等缺陷。

多重PCR法：在同一PCR反应体系里加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂、操作过程与一般PCR相同。多重PCR与普通PCR相同，不用将样本打断，数据完整，但是扩增具有偏向性。免疫基因多样性的进化通过基因复制、基因突变完成，可通过设计多重PCR扩增引物扩增得到目的BCR/TCR基因。该方法通常在V区和J/C区的保守区域设计引物实现多重PCR扩增，但由于引物不同PCR扩增的效率必然不同造成扩增偏差(amplification bias)，有些引物被大量扩增有些却几乎没有扩出来，只有通过几次优化找到最优的引物浓度组合来消除PCR扩增偏差，但这种方法对新的引物不具有通用性，因而增加了寻找最佳引物浓度的复杂性。通常可变区基因的克隆，是参考Kabat数据库中的抗体序列，针对抗体可变区的保守区域设计若干套通用引物，采用RT-PCR法从人的淋巴B细胞的cDNA文库中扩增可变区基因，该方法简单实用，通常5’端通用引物设计在第一骨架区或前导肽区；3’端通用引物设计在恒定区或J链区，但是该方法得到的抗体序列比较短，FR1前的序列无法测到。