[发明专利]一种游离DNA提取试剂盒

说明书

本发明提供了一种游离DNA提取试剂盒，用于提取血浆中游离DNA，包含脂质体磁珠溶液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液以及磁分离架。脂质体磁珠溶液含有脂质体磁珠，该脂质体磁珠用于吸附血浆内游离DNA并使得DNA被分离。本发明提供的脂质体磁珠溶液中脂质体磁珠具有粒径小、带正电以及纯度高等特点，有利于在血浆中高效地与游离DNA充分结合，能最大程度地分离提取血浆中的游离DNA。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种游离DNA提取试剂盒。

背景技术

液体活检(liquid biopsy)，作为体外诊断的一个分支，是指通过检验血液或者其他体液如尿液、唾液、胸腔积液、脑脊液等，对癌症等疾病做出分析诊断。包括循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、microRNA以及微泡。其中，ctDNA发展最为迅猛。目前液体活检主要应用领域是肿瘤的血液检测，即利用血液提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗。

1948年，首次在人类血液中发现了游离DNA(cell free DNA，cfDNA)。30年后，发现癌症病人中有更高含量的cfDNA。随后发现，ctDNA也在cfDNA中。cfDNA一部分来源于正常细胞凋亡的DNA，另一部分来源于ctDNA，而ctDNA在cfDNA所占的比例有很大变化，低至0.01％，高达超过60％，这和肿瘤的大小和进展有关。

一般认为在血液循环系统中存在的cfDNA是由癌细胞的凋亡和坏死后释放到其周围微环境，同时自身的分泌细胞代谢也可能是一种潜cfDNA。坏死和凋亡的细胞一般会被巨噬细胞和其他清除细胞吞噬清理，被吞噬的坏死癌细胞可以将被消化的DNA释放到其组织环境中。在体外细胞培养实验中表明，cfDNA释放的过程中巨噬细胞可以被激活或死亡。cfDNA的整体含量也会受到血液和淋巴循环系统的清除、降解和其他生理净化过程而波动。存在于血液的核苷酸会被机体的肝脏和肾脏代谢清除，所以cfDNA在血液中存在一定的半衰期，一般由15分钟到几个小时不等。

由于血浆内的游离DNA(Cell-free DNA，cfDNA)含量少，且存在不稳定，使得提取及保存cfDNA成为了实验难点。影响提取cfDNA量的因素过多，如血样保存的时间，血样存储的温度，血样离心转速及时间，血样提取时应用的抗凝剂等都对提取含量有影响。现发现乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝作用优于柠檬酸和肝素的作用，而二次离心法便于更好的收集cfDNA。研究证明，假如一个患者携带了约100g左右的肿瘤组织，相当于3×10¹⁰个肿瘤细胞，每天大约会有3.3％的肿瘤细胞会进入到血液循环系统中。平均来说这种DNA的大小最小的约为200bp，最大的有21kb。在血液中的循环肿瘤细胞及其肝脏和骨髓产生的微积物，都会造成cfDNA的释放。与正常人相比，肿瘤患者体内存在大量的ctDNA，它们来自于凋亡或/和坏死的肿瘤细胞，这些源于肿瘤组织或循环肿瘤细胞的DNA片段携带着肿瘤特异性DNA序列进入血液循环，形成了可在外周血中检测到的ctDNA。相关研究显示，对于癌症患者每毫升血液中可以得到最少0ng最多大于1000ng的ctDNA，平均每毫升血液中含有180ng的ctDNA。而正常健康人群中每毫升血液最多可以提取到100ng的cfDNA，平均每毫升30ng。

研究表明，不同的cfDNA提取方法使得收集血样中的cfDNA浓度与纯度都不同。传统的提取cfDNA方法有酚-氯仿法，QIAgene试剂盒法，Omega法以及传统磁珠法。但是酚-氯仿法提取的效果不理想，QIAgene试剂盒法以及Omega法虽能有效的清除血浆中的各种血液成分，如血浆蛋白，细胞碎片等，但这两种方法在提取cfDNA的过程中对cfDNA的丢失率达到70％－80％。传统磁珠法虽然优于以上三种方法，提取cfDNA的效率最高质量只好，但是提取cfDNA的量很有限，得到的cfDNA任然不能满足下续实验的要求。