[发明专利]一种简易的斑点杂交加样方法

说明书

本发明公开了一种简易的斑点杂交加样方法，包括如下步骤：猪耳缘成纤维细胞的培养；细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；进行斑点杂交；分析结果，比较灰度值。本发明整合利用了实验室里现有的资源，仅仅利用了盛装白枪头的层板和恒温金属浴，节省了很多耗材，而且省下了安装多管吸印仪耗费的时间和人力，还对加样操作进行了简化，对于技术优化具有重大意义。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体是一种简易的斑点杂交加样方法。

背景技术

斑点杂交(Dot Blot)是一种检测、分析和鉴定DNA、RNA和蛋白质的技 术。将待测样品滴加到硝酸纤维素膜(或尼龙膜、NC膜)上，然后通过烘烤 或紫外线照射的方法来固定样品，接下来用已标记的探针进行杂交，然后洗 膜(除去未接合的探针)，最后放射自显影，通过显影斑点的有无及颜色的 深浅来判断是否有杂交及其杂交强度。本方法耗时短，可做半定量分析，并 且效率高，一张膜上可以同时点上多个样品，对其相关特征进行检测。

在斑点杂交的操作流程中，加样这一步是至关重要的，如果加样时操作 不佳，可能会使得样品在膜上扩散，这样不但使显影后的区域呈现出非斑点 状，影响实验结果的美观，还会因为样品的分散，对灰度的分析带来麻烦， 甚至影响到结果分析的准确性。更有甚者，样品的扩散会导致样品孔之间交 叉污染，直接导致实验结果的不准确或实验失败。因此，利用斑点杂交进行 相关样品的检测时，势必要在加样这一步下功夫，加样的优劣很大程度上影 响着整个实验。为了使加样时避免出现上述情况，现在市售有多种多管吸印 仪(Manifold)，如Minifold Ⅰ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、 Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它们有许多孔，且膜下和膜上会形成很大的 负压，这样的话样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状， 不会出现样品扩散，从而影响结果的美观性，甚至准确性的情况。这样的确 保证了印迹的高品质，也正是因为如此，许多发明、科研所或者其他可以进 行斑点杂交的工作人员在实践时，都会使用多管吸印仪来确保加样这一步骤 的质量，从而确保整个实验的质量。但是，购买多管吸印仪需要花费一定的 费用，而且其安装和操作也较为繁琐，无形之中耽误了实验者的时间，也给 操作立起了一道门槛，给实验新手的入门带来一定的困难。因此，如果能够 利用发明的现有资源，创造出一种在不影响实验效果前提下的更简单易行的 斑点杂交加样方法，会大大地简化实验操作，使得斑点杂交易于上手，可以 大量地进行，并且能够节省时间，从而提高科研效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简易的斑点杂交加样方法，以解决上述背景 技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种简易的斑点杂交加样方法，包括如下步骤：

(1)猪耳缘成纤维细胞的培养；

(2)细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；

(3)添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的 合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于 85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴 紧密接触；

(4)进行斑点杂交；

(5)分析结果，比较灰度值。

优选地，步骤(1)中，猪耳缘成纤维细胞培养的具体步骤如下:

①解冻两管冻存于液氮中的猪耳缘成纤维细胞于两个直径9cm的培养皿 中，在温度为37℃，CO₂体积分数为5％的平衡箱中培养；