[发明专利]一种简易的斑点杂交加样方法

权利要求书

1.一种简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)猪耳缘成纤维细胞的培养；

(2)细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整；

(3)添加样品：预热金属浴至85℃，并将硝酸纤维素膜裁剪至所需要的合适大小；通过美纹纸将硝酸纤维素膜固定于层板上；在硝酸纤维素膜上于85℃烘烤下进行加样；加样后用重物压住层板，以使硝酸纤维素膜和金属浴紧密接触；

(4)进行斑点杂交；

(5)分析结果，比较灰度值。

2.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(1)中，猪耳缘成纤维细胞培养的具体步骤如下:

①解冻两管冻存于液氮中的猪耳缘成纤维细胞于两个直径9cm的培养皿中，在温度为37℃，CO₂体积分数为5％的平衡箱中培养；

②培养一定时间后，在显微镜下观察，待贴壁的细胞面积达到皿底面积的95％时，对照组更换新的培养基，试验组更换含有浓度为20mM的环亮氨酸的培养基，继续在平衡箱中培养48h。

3.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(2)中，细胞RNA的提取、浓度的测定以及调整的具体步骤如下：

①在显微镜下观察对照组和试验组的细胞是否生长良好，若细胞表现为贴壁，且面积达到皿底面积的95％，则进行RNA的提取；

RNA的提取分三组，分别是：

293T-作为阳性对照，作用是用于检测样品是否附着于硝酸纤维素膜上，以及成像是否正常等；

对照组-用作空白对照的猪耳缘成纤维细胞；

试验组-添加环亮氨酸处理48h之后的猪耳缘成纤维细胞；

②先提取RNA，对三组RNA的浓度进行测定，再调整RNA浓度，使得三组RNA的浓度一致；

③提取293T细胞的RNA具体过程如下，其他两组RNA提取方法与之相同：

a.预处理：将无RNA酶的枪头放入超净台中紫外照射30min，打开金属浴55℃，预热DEPC水；

b.将293T细胞的培养液PAF弃掉，然后用PBS清洗两遍，弃掉PBS后加入1mL的Trizol裂解细胞；

c.将装有RNA样品的1.5mL离心管放在涡旋震荡仪上震荡30s-60s，随后置于冰上静止2min；

d.将裂解后的细胞-Trizol混合物移入1.5mL离心管中，再加入400μL的氯仿，迅速混匀，震荡2min，然后迅速插在冰上静止，随后在4℃下，转速13000rpm离心10min，离心后，将该离心管静置于冰上，用吸取上层水相清液，将清液置于另一1.5mL离心管中，并放于冰上；

e.向上步装有清液的离心管中加入40μL异丙醇，充分混匀后置于-80℃冰箱30min后取出，在4℃下，转速12000rpm离心15min；

f.弃掉上步的上层清液，留下底部白色沉淀，加入体积分数为75％的RNAse free乙醇800μL洗涤沉淀，4℃下，转速12000rpm离心10min；

g.重复上述步骤一次；

h.将离心管在4℃下转速为12,000rpm离心2min，将剩余的75％RNAse free乙醇吸走，留下沉淀，再静置2min以确保乙醇完全挥发；

i.取31μL加热至55℃的DEPC水于上步的RNA沉淀中，用移液器吹打混匀至沉淀完全溶解后，吸取1μL于分光光度计中，测量浓度并记录相关数值；

j.将所有组的RNA样品的浓度调一致，用于斑点杂交。

4.根据权利要求1所述的简易的斑点杂交加样方法，其特征在于，步骤(4)中，斑点杂交的具体步骤如下：

①RNA变性：使三组RNA样品在95℃下变性10min，以破坏其二三级结构，然后迅速置于冰上冷却2min，使其结构稳定在一级结构；

②在进行步骤①的同时将硝酸纤维素膜于金属浴85℃中预热，待步骤①的RNA样品处理好之后用无RNA酶的枪头进行梯度加样，第一排点1μL，第二排点2μL，然后85℃烘烤6h；

③将梯度加样后的三组RNA样品于水平摇床中用质量分数为5％的BSA常温封闭2h；

④加m6A一抗于5％BSA中，按1:5000的体积比进行稀释，置于4℃摇床上12h以上；

⑤次日早晨，常温下在水平摇床中用1XPBST洗一抗，6次，6min/次；

⑥将二抗以3:10000的体积比进行稀释于水中,再将该稀释后的二抗与质量分数为5％的牛奶混合，水平摇床，常温，105min；

⑦常温下在水平摇床中用1XPBST洗二抗，5次，5min/次；

⑧配制显影液，将NcmECL Ultra Enhancer Reagent(A)和NcmECL Ultra Stabilizedperoxide Reagent(B)按体积比例1:1混合；

⑨进行放射自显影。