[发明专利]单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法

说明书

本发明提供单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法。单元DNA组合物的制备方法包括下述工序：准备各自含有连结有附加序列的多个单元DNA中的每一种所述单元DNA的溶液的工序；和，在准备各溶液后，在单元DNA连结有附加序列的状态下，测定各溶液中的单元DNA的浓度，基于其结果分取各溶液，使各溶液中的单元DNA的摩尔数接近于彼此相同的工序。DNA连结体的制作方法包括下述工序：制备单元DNA组合物的工序、准备载体DNA的工序、用限制性内切酶从制备得到的溶液中的连结有附加序列的单元DNA中除去各附加序列的工序、和在除去工序后将载体DNA及各单元DNA彼此连结的工序。

本申请是申请日为2014年9月5日、发明名称为“单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法”的中国发明专利申请201480073826.9(PCT申请号为PCT/JP2014/073579)的分案申请。

技术领域

本发明涉及单元DNA组合物的制备方法及DNA连结体的制作方法。

背景技术

近年来，对以构建基因组水平的长链DNA等为目的的DNA合成技术的开发正日益盛行。作为DNA的合成技术，将通过化学合成DNA、PCR法扩增得到的单元DNA组装起来的技术是已知的。但是，已知在化学合成DNA的合成过程和PCR法中突变被随机地导入合成的DNA中。因此，在基因的组装中，在直到最后一个阶段为止的所有阶段都必须要进行对DNA的序列加以确认、以及选择具有期望的序列的DNA的过程。

为了对碱基序列进行确认，通常通过利用双脱氧链终止法(Sanger法)的自动荧光测序仪来进行碱基序列测定，采用该方法能够在1次碱基序列测定中对连续长度为800碱基左右的碱基序列加以确认。在基因组装前要对利用化学合成、PCR法合成的单元DNA碱基序列进行确认的情况下，如果碱基序列测定的次数少，则可以削减时间、费用的成本。因此，对用于基因组装的利用化学合成、PCR法合成的单元DNA而言，短是优选的。

然而，如果用于基因组装的单元DNA短，则需要组装很多个单元DNA。

目前，作为将多个单元DNA组装起来的方法之一，已知有利用了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的质粒转化体系的基因组装法(OGAB法)。例如，专利文献1中公开了使用了OGAB法的枯草芽孢杆菌细胞转化用质粒DNA的制作方法。

OGAB法中，使用了通过在质粒分子间进行同源重组从而在1个DNA分子中存在多个质粒单元的所谓多聚体质粒(multimer plasmid)。采用OGAB法时，转化用的DNA分子不需要是环状DNA，只要形成为质粒的1个单元和用于组装的各个单元DNA得以在同一方向上重复出现的串联重复状(tandem repeats)，就可能实现质粒的转化。

OGAB法中，如上所述，需要制备连接(ligation)为串联重复状的DNA分子，因此，使用多个单元DNA时，需要将这些单元DNA和质粒连结。但是，单元DNA的种类越多，越难以将这些单元DNA连结并制作串联重复，为了使数量较多的单元DNA连结，连接时的各单元DNA的摩尔比接近于1是令人期望的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4479199号公报

发明内容