[发明专利]一种耦合发酵制备海藻糖的方法

说明书

本发明涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法。本发明通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P₄₃、信号肽PhoD同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC以及麦芽糖转运蛋白基因EIICB后，构建获得重组工程菌pHT01‑P₄₃‑PhoD‑treS(LM12345)，通过实际发酵生产海藻糖后，惊奇的发现，由于改造后的重组菌胞外酶活能够占到总酶活的70％，实现了胞外产酶与转化的同步进行，从而省去了传统发酵液中需要先进行酶分离然后再进行海藻糖生产的过程，实现了重组菌的发酵与海藻糖的生产同于耦合化。

技术领域

本发明涉及一种耦合发酵制备海藻糖的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subttlis)是原核生物研究领域中的重要模式菌，人们对其遗传背景和生理特征的了解仅次于大肠杆菌(Escherichia coli)。枯草芽孢杆菌是一类革兰氏阳性好氧型杆菌，是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主。该宿主的优点是：公认的安全菌株，分泌表达，无明显的密码子偏爱性；生长快，易培养，表达量高，遗传背景清楚以及分子操作简单的特点，且适合工程菌株改造等显著优势。

基因工程中，信号肽是实现外源蛋白分泌表达的重要组成元件。信号肽的选择及其成熟蛋白的融合，信号肽的功能在于引导前体蛋白与易位复合体结合并调节前体蛋白的折叠，在对蛋白分泌过程中起着重要作用。信号肽是一类具有15～60个氨基酸的多肽，一般定位于分泌蛋白的N端。一般是将编码目的蛋白的基因序列克隆至信号肽的C端，从而在宿主菌中实现目的基因和信号肽序列在转录和翻译水平的融合。信号肽引导整个多肽链与胞内分子伴侣或者分泌信号识别位点的结合，进而跨膜转运至胞外。因此。研究不同种类的信号肽对于实现外源蛋白基因的高效表达和分泌机制等均有重要意义。

发酵工程中，目前用于生产海藻糖合酶的菌种多是在细胞内表达，而且表达量低，转化麦芽糖时，只能在发酵结束后，将菌体破碎得到粗酶液，再与麦芽糖混合转化，这种生产方式生产过程复杂，消耗时间长，生产成本高，不利于大规模生产制备海藻糖。而耦合发酵技术可以将发酵过程与转化过程结合起来，同时进行，极大地简化生产过程，降低生产成本，为工业化生产制备海藻糖具有重要意义。

中国专利文献CN103215300A(申请号201310174692.7)公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。虽然该技术中的海藻糖合酶可以分泌到胞外，但仍然无法实现耦合发酵生产海藻糖。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种耦合发酵制备海藻糖的方法。

本发明通过启动子及信号肽密码子的筛选及优化、无痕敲除技术的应用，构建了高效分泌表达海藻糖合酶的工程菌，并通过对发酵技术的创新及优化实现了耦合发酵制备海藻糖的方法。

本发明技术方案如下：

一种耦合发酵制备海藻糖的方法，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43-F/P43-PhoD-R、PhoD-P43-F/PhoD-TreS-R进行PCR扩增，分别制得P₄₃基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS-PhoD-F/TreS-R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS基因片段；通过重叠PCR连接P₄₃基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P₄₃-PhoD-treS基因片段；

所述引物对的核苷酸序列分别如下：