[发明专利]一种耦合发酵制备海藻糖的方法

权利要求书

1.一种耦合发酵制备海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，分别用引物对P43-F/P43-PhoD-R、PhoD-P43-F/PhoD-TreS-R进行PCR扩增，分别制得P₄₃基因片段、PhoD基因片段；以TreS基因为模板，用引物对TreS-PhoD-F/TreS-R进行PCR扩增，制得长度为2067bp的treS片段；通过重叠PCR连接P₄₃基因片段、PhoD基因片段和treS片段，制得P₄₃-PhoD-treS基因片段；

所述引物对的核苷酸序列分别如下：

P43-F：CGCGGATCCAGCTTCGTGCATGCAGGC；下划线为BamHI酶切位点

P43-PhoD-R：CTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATA；

PhoD-P43-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTCGTTTTGATGAATGG；

PhoD-TreS-R：CTGGGTCATTACTTCAAAGGCCCCAACCG；

TreS-PhoD-F：GGCCTTTGAAGTAATGACCCAGCCCGACCC；

TreS-R：GACGTCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTCAAACATGCCCGCTGCTGT；

下划线为Aat II酶切位点；

所述P₄₃基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；PhoD基因片段为经过密码子优化的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)制得的P₄₃-PhoD-treS基因片段插入载体pHT01，制得pHT01-P₄₃-PhoD-treS重组载体；

(3)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增得到基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB，所述基因Xpf的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述基因SkfA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述基因LytC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述基因SdpC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述基因EIICB的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，将上述基因Xpf、基因SkfA、基因LytC、基因SdpC、基因EIICB分别连接到敲除载体后，制得敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、-ΔSkfA、-ΔLytC、-ΔSdpC、-ΔEIICB，然后将敲除载体质粒pMAD-ΔXpf、pMAD-ΔSkfA、pMAD-ΔLytC、pMAD-ΔSdpC、pMAD-ΔEIICB分别转化B.subtilis WB800n感受态细胞，制得重组菌LM12345；

(4)将步骤(2)制得的pHT01-P₄₃-PhoD-treS重组载体转化步骤(3)制得的重组菌LM12345的感受态细胞，制得自诱导分泌型重组菌pHT01-P₄₃-PhoD-treS；

(5)将步骤(4)制得的自诱导分泌型重组菌pHT01-P₄₃-PhoD-treS经种子培养、扩大培养后，按3～5％的体积百分比接种至发酵培养基中，在温度35～38℃，转速350～500rpm，发酵培养56～72h，发酵5～8h后，开始流加混合糖液，发酵结束，经纯化，制得含有海藻糖的发酵液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，长度为2067bp的treS片段核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。