[发明专利]一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法

权利要求书

1.一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)、取新鲜的三角肌组织或受创3-7天内的三角肌，用无菌、无热源的磷酸盐缓冲液进行冲洗，冲洗后的三角肌进行组织绞碎，直至组织的颗粒粒径不大于1mm，得到肌肉组织匀浆；

(2)将肌肉组织匀浆按照酶底物浓度加入胶原酶和中性蛋白酶的混合液来降解消化，得到单个的肌肉干细胞，于37℃下温育1小时，再经灭酶活后得到肌肉组织酶解液；

(3)肌肉组织酶解液通过2000转/分离心得到细胞，再用磷酸缓冲液进行冲洗，再离心得到清洗的细胞，把细胞悬浮于细胞生长培养液，用70微米孔径进行过滤，滤去杂质，通过滤膜的细胞被收集，加入带胶原蛋白铺层的细胞培养板中，用预板培养法分离培养出有活跃再生能力的肌肉干细胞，体外培养的肌肉干细胞每20-22小时增生一倍；

(4)肌肉干细胞用干细胞生长培养液培养至78-82％密集度时，移出培养液，用无菌、无热源的PBS清洗细胞3次，加入无血清培养液继续培养48小时，然后收集无血清培养液；

(5)将收集的无血清培养液进行过滤去处细胞碎片和杂质，然后移入浓缩管中浓缩，再进行冷冻干燥处理，得到冻干粉；未被收集的细胞利用胰酶消化液消化后，用PBS对细胞清洗3次，离心得到细胞团，把细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，置于冰上，用超声细胞破碎仪进行超声裂解，得到细胞裂解液，再经过滤，既得到干细胞提取液；

(6)将细胞无血清培养液的提取物的冻干粉加入到干细胞提取液中，得到肌肉干细胞混合提取物；

(7)肌肉干细胞混合提取物中加入海藻丙二醇酯、羟甲基纤维素、黄原胶蛋白活性稳定剂以保持活性因子的活性，加入纳他霉素、乳酸链球菌素防腐剂和一定比例的氮酮、二甲基亚砜溶液，即得到干细胞活性因子组合物，将得到的细胞因子组合物放置于2℃-8℃下备用。

2.根据权利要求1所述的一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中海藻丙二醇酯的浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml、羟甲基纤维素的浓度为0.1mg/ml-1.0mg/ml、纳他霉素的度为0.002mg/ml-0.01mg/ml、乳酸链球菌素的浓度为0.01mg/ml-0.05mg/ml、氮酮的浓度为0.005g/ml-0.2g/ml、DMSO的质量比为0.1％-1％。

3.根据权利要求1所述的一种具有肌肉细胞修复功能的干细胞活性因子组合物的制备方法，其特征在于，所述的细胞生长培养液的成分包括DMEM培养基、体积分数为10％的胎牛血清、浓度为0.2ng/mL-0.8ng/mL的干细胞生长因子(SCF)、浓度为10ng/mL-80ng/mL的粒细胞刺激因子(G-CSF)。