[发明专利]一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法

说明书

本发明公开了一种L‑谷氨酸氧化酶纯化方法。包括：通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD‑AB；在蛋白标签后融合目的蛋白LGOX基因；将连接蛋白标签ChiBD‑AB和目的蛋白LGOX基因的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；在粗酶液中加入几丁质作为吸附剂，之后洗脱，获取纯化酶液。本发明所使用的蛋白纯化标签ChiBD‑AB对几丁质具有特异性吸附能力，可从源头上杜绝杂蛋白的混入；使用试剂成本低，蛋白纯化方法操作简便，可适应大规模应用。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法。

背景技术

蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术，是蛋白质后续性能表征的基础。蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。目前常见的蛋白纯化方法有：

(1)根据分子大小不同的分离方法，透析和超过滤(利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质)；密度梯度离心(蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快)；凝胶过滤(一种柱层析)；

(2)利用溶解度差别分离，等电点沉淀法(由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)；

(3)根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；

(4)蛋白质的选择吸附分离(利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的)；

(5)根据配体特性的分离——亲和层析(利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质)；

(6)低温有机溶剂沉淀法，用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出。

其中，蛋白质亲和层析技术适应于理化性质差异性较小而难分离的蛋白质，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。它通常只需要一步操作便能将目的蛋白从混合物中分离出来，并且纯度很高。目前最常见的蛋白质亲和层析方法为使用负载有镍离子的吸附胶吸附带有His-tag的目的蛋白后使用以咪唑为有效成分的洗脱液洗脱并收集目的蛋白。