[发明专利]一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法有效
| 申请号： | 201811306399.0 | 申请日： | 2018-11-05 |
| 公开（公告）号： | CN109321539B | 公开（公告）日： | 2022-05-06 |
| 发明（设计）人： | 董维亮;陈建豪;周杰;徐宁;姜岷 | 申请（专利权）人： | 南京工业大学 |
| 主分类号： | C12N9/06 | 分类号： | C12N9/06 |
| 代理公司： | 江苏致邦律师事务所 32230 | 代理人： | 徐蓓;尹妍 |
| 地址： | 211816 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 谷氨酸 氧化酶 纯化 方法 | ||
1.一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，包括：
通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD-AB；
在蛋白标签后融合目的蛋白LGOX基因；所述LGOX基因Genbank登录号为：AB085623.1；
将连接蛋白标签ChiBD-AB和目的蛋白LGOX基因的质粒导入宿主菌株表达，获取粗酶液；
在含有目的蛋白的粗酶液中加入几丁质吸附剂20℃孵育30分钟，所述几丁质吸附剂经超声处理；
离心后去除上清液，使用磷酸盐缓冲液冲洗吸附剂以去除残留杂蛋白；
采用NaCl溶液，通过梯度洗脱的方式洗脱吸附剂，收集洗脱液；使用超滤法浓缩目的蛋白，获取纯化酶液；
其中，所述蛋白标签ChiBD-AB的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，带有蛋白标签ChiBD-AB的质粒构建方法如下：
通过PCR方法扩增蛋白标签ChiBD-AB的基因序列；
将扩增的ChiBD-AB基因片段通过一步克隆的方法与线性化的pET系列质粒连接，获取连接蛋白标签的质粒；
将连接蛋白标签的质粒导入大肠杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基进行培养，通过Kan抗性与菌落PCR筛选出阳性转化子；
挑取验证正确的转化子，接入液体培养基中培养后提取质粒并测序，获取验证正确的质粒pETAB。
3.根据权利要求2所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，所述载体质粒选用pET-29a。
4.根据权利要求3所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，选择
5.根据权利要求2所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，在蛋白标签后融合目的蛋白基因的方式如下：
通过PCR方法扩增出带有同源臂的目的蛋白基因片段；
选取所需酶切位点将pETAB线性化；
通过一步克隆的方法将目的蛋白LGOX基因与线性化的质粒pETAB连接，导入大肠杆菌感受态细胞中，涂布于固体培养基进行培养，通过Kan抗性与菌落PCR筛选出阳性转化子；
挑取验证正确的转化子，接入含有卡那霉素液体培养基中培养后提取质粒并测序，获取验证正确的质粒pETAB-LGOX。
6.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，目的蛋白基因表达方法为：
将连接蛋白标签ChiBD-AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株；
培养过程中加入IPTG诱导表达目的蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种L-谷氨酸氧化酶纯化方法，其特征在于，所述几丁质吸附剂添加量为30 g/L。
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