[发明专利]一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用

说明书

本发明提供一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用，本发明通过发酵培养解淀粉芽孢杆菌MG‑3制备发酵液，从发酵液中分离纯化抗菌蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，建立抗菌蛋白的实验纯化方法并鉴定该抗菌蛋白，研究其稳定性，并应用在枇杷上研究其保鲜效果，为更好地研究利用该菌株及其抗菌物质防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用。

背景技术

果蔬具有营养丰富、含水率高等特点，是人们生活消费品之一，但采摘和贮运过程中，新鲜果蔬容易受到机械损伤，一旦受到损伤果蔬致病真菌就更容易侵染伤口并且大量繁殖，会加速果蔬腐烂，缩短保质期。因此，防治果蔬病害成为农业产业化，规模化发展亟需解决的问题之一。目前，应用于防治果蔬病害大多采用化学杀菌剂，长期使用化学杀菌剂不仅病原菌易产生抗药性、污染环境等问题，而且也可能危害人类的健康。因此各国相关领域科研工作者一直致力于找寻新型，高效，清洁的生防技术，能够减少以及逐步取代化学杀菌剂的使用。近年，利用拮抗菌进行果蔬病害的生物防治，是一种安全高效并具有广阔的应用前景而迅速发展为研究热点之一。土壤放射菌、芽孢杆菌、链霉菌、假单胞菌等是目前主要应用于生物防治的微生物。其中芽孢杆菌不仅自身抗菌广、防治病害能力强，而且次生代谢产物中含有多种抗菌物质，是目前国内外生物防治的研究热点之一。

抗菌蛋白质是由芽孢杆菌发酵分泌的物质，一般芽孢杆菌发酵液中含有很多物质，包括抗菌蛋白，脂肽类，还有一些其他蛋白。研究芽孢杆菌的抗菌蛋白等物质的结构和功能，能更好的将其应用于市场，需要将抗菌蛋白从芽孢杆菌发酵液中分离纯化出来。目前，实验室对于蛋白的分离纯化一般经过两个阶段，一是蛋白质的粗提，可以采用盐析、有机溶剂沉淀、透析和超滤等；另一过程是精提，通过离子交换层析、分子凝胶层析、疏水层析以及亲和层析等技术的组合，来获得单一条带的目的蛋白。

本发明通过从福建农林大学食品科学院提供的解淀粉芽孢杆菌MG-3发酵培养，从菌株MG-3分泌的次级代谢产物中纯化抗菌蛋白，建立抗菌蛋白的实验纯化方法，鉴定该抗菌蛋白，研究其稳定性，并应用在枇杷上研究其保鲜效果，为更好地研究利用该菌株的抗菌物质防治果蔬病害提供依据，并为实现微生物杀菌剂的工业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种丝氨酸蛋白酶及其在枇杷保鲜上的应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

丝氨酸蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的工艺流程如下：

将解淀粉芽孢杆菌MG-3发酵培养，制备发酵液并通过硫酸铵沉淀获得抗菌蛋白粗提液；通过层析方法分离纯化抗菌蛋白；抗菌蛋白的质谱鉴定；探究抗菌蛋白的稳定性，如温度、pH、有机溶剂、紫外线、蛋白酶K；抗菌蛋白对枇杷保鲜的应用。

从超低温冰箱取出解淀粉芽孢杆菌MG-3，将菌株MG-3活化，培养种子液，培养发酵液。将发酵液低温高速离心，弃菌体取上清，根据硫酸铵分级盐析法，将发酵上清液按不同硫酸铵饱和度沉淀分离，验证其沉淀蛋白的活性和纯度，将具有抗菌活性的40%硫酸铵饱和度沉淀蛋白利用离子交换层析分离纯化，采用线性梯度方法洗脱，得到4个洗脱峰（见图1），经过透析，浓缩处理，验证四个样品的抗菌活性，确定峰4具有明显的抗菌活性，再检验峰4的纯度，进而确定需要进一步分离纯化。根据凝胶层析原理，将处理好的峰4样品上样于Sephacryl S-200凝胶层析，获得2个洗脱峰（见图2），同样验证其抗菌活性，得到的峰4-1具有抗菌活性，说明峰4-1样品中含有活性蛋白，再利用SDS-聚丙烯电泳检测其蛋白纯度，结果显示峰4-1样品含有一条明显条带，达到电泳纯，分子量在45KDa左右。实验结果说明解淀粉芽孢杆菌MG-3的发酵液经过三步分离纯化步骤，获得具有抗菌活性峰4-1样品蛋白达到电泳纯，分子量在45KDa左右。