[发明专利]一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法

说明书

本发明公开了一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，包括以下步骤：1)用密度梯度离心法分离外周血单核细胞；2)用唑来膦酸和白细胞介素‑2活化培养所述外周血单核细胞，从而获得γδT细胞；3)用仙台病毒载体将胚胎干细胞相关基因转移到所述γδT细胞中，从而引入可诱导其转变成多能干细胞的重编程因子；4)用灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞共培养所述γδT细胞，促进其转变成iPSCs；5)待所述γδT细胞转变成iPSCs后，用胚胎干细胞培养基培养。本发明生产的γδT‑iPSC可分化为造血祖细胞。这种新技术将为新型免疫治疗的新途径铺平道路，可以应用于各种类型的癌症。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。T细胞为免疫细胞的一种，根据T细胞表面受体(TCRs)的不同可将T细胞分为αβT细胞和γδT细胞。αβT细胞表面受体为TCR2(T细胞表面受体2)，它在外周血单核细胞(PBMC)中的含量为65-75％，αβT细胞中CD4+的占60％，CD8+占30％，CD4+CD8+不到1％，αβT细胞根据其表面标记CD4+和CD8+分别受MHCⅡ类分子和MHCⅠ类分子限制，需要抗原递呈细胞进行抗原递呈才能发挥免疫效应应答，这类T细胞也是目前免疫治疗中应用最广泛的细胞，例如car-T治疗和细胞毒性T细胞(CTL)治疗等；γδT细胞与αβT细胞不同，其表面受体为TCR1(T细胞表面受体1)，该类型受体不受MHC分子限制，CD4与CD8的表达均为阴性。

γδT细胞优于淋巴因子激活的杀伤细胞，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用。但是γδT细胞在外周血PBMC中仅占不到10％，并且γδT细胞在传统方法的体外扩增过程中其扩增能力与杀伤会随之减弱，出现明显的由于因子诱导的扩增细胞效用耗尽的现象。为了克服传统的T细胞在制备生产中的这些问题，人们尝试将T细胞诱导为多能干细胞T-IPSC，其拥有相同的T细胞受体(TCR)基因作为其原始T细胞，这为抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)提供了几乎无限的来源。然而，这些技术主要集中在αβT细胞上，并且需要大量抗原特异性CTL，它们通过HLA肽多聚体的细胞分选纯化，作为原始的IPS细胞。

目前国内外临床上用于辅助治疗及医疗保健中的免疫T细胞在商品化大规模生产中存在诸多缺陷，如T细胞在传统方法的体外扩增过程中其扩增能力与杀伤会随之减弱，出现明显的由于因子诱导的扩增细胞效用耗尽，传统αβ来源的CTL受MHC限制，而γδT在外周血中含量低，纯化扩增困难的问题，并且在αβT细胞诱导为IPSC技术上存在，需要大量抗原特异性CTL，还要通过HLA肽多聚体的细胞分选纯化，作为原始的IPS细胞等难题。

发明内容

针对于目前国内外临床上用于辅助治疗及医疗保健中的免疫T细胞在商品化大规模生产中的诸多缺陷，本发明提供了一种高效、方便的产生包含TCRG和TCRD基因区重排而不需要进行细胞分选的IPSC(γδT-IPSC)生产方法。

具体地，本发明提供了一种用于将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，包括以下步骤：

1)用密度梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)；

2)用唑来膦酸和白细胞介素-2活化培养所述外周血单核细胞，从而获得γδT细胞；

3)用仙台病毒载体将胚胎干细胞相关基因转移到所述γδT细胞中，从而引入可诱导其转变成多能干细胞的重编程因子；

4)用灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞共培养所述γδT细胞，促进其转变成诱导性多能干细胞(iPSCs)；

5)待所述γδT细胞转变成iPSCs后，用胚胎干细胞培养基培养。

进一步，步骤1)的具体操作过程为：