[发明专利]一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法

权利要求书

1.一种将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用密度梯度离心法分离外周血单核细胞；

2)用唑来膦酸和白细胞介素-2活化培养所述外周血单核细胞，从而获得γδT细胞；

3)用仙台病毒载体将胚胎干细胞相关基因转移到所述γδT细胞中，从而引入可诱导其转变成多能干细胞的重编程因子；

4)用灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞共培养所述γδT细胞，促进其转变成iPSCs；

5)待所述γδT细胞转变成iPSCs后，用胚胎干细胞培养基培养。

2.如权利要求1所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤1)的具体操作过程为：

①用淋巴细胞分离液将全血血液离心分离，分别收集其中的血浆层和白膜层；

②用生理盐水清洗白膜层，然后离心收集白膜层细胞；

③用收集的血浆重悬所述白膜层细胞。

3.如权利要求2所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤①所述淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。

4.如权利要求2所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤①所述离心的转速为380-420g，离心时间为25-35分钟。

5.如权利要求2所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤②所述离心的转速为1500-1800rpm，离心时间为8-12min。

6.如权利要求1所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤2)的具体操作过程为：将所述白膜层细胞接种至含有唑来膦酸的DMEM-F12培养基中，在恒温37℃，CO₂浓度为5％的条件下培养20-28小时后加入白细胞介素-2，继续培养10天以上，获得γδT细胞。

7.如权利要求1所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤3)的具体操作过程为：将培养获得的γδT细胞用γδT完全培养基继续培养3-5天，然后用γδT完全培养基重悬所述γδT细胞，将细胞浓度调整为2.5×10⁶–5×10⁶/mL，在0.9-1.1mL待诱导的细胞悬液中加入CytoTun-iPS仙台病毒重编程序试剂盒中的三种Yamanaka四因子病毒：Klf4&Oct4病毒、Sox2病毒与c-Myc病毒，诱导20-28小时；

其中，所述γδT完全培养基的配方如下：

Stem Pro34无血清培养基为基础培养基，其中含有体积比为2.5％的StemPro-34营养补充剂、100ng/mL的重组人干细胞因子SCF、100ng/mL的FMS相关酪氨酸激酶3配体、20ng/mL的IL-3和10ng/mL的IL-6。

8.如权利要求7所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，加入Klf4&Oct4病毒的量为MOI＝3，加入Sox2病毒的量为MOI＝5，加入c-Myc病毒的量为MOI＝5。

9.如权利要求1所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤4)的具体操作过程为：用Stem Pro34无血清培养基将所述γδT细胞移入铺了灭活的人皮肤成纤维滋养层细胞的培养瓶中，接种密度为2-8×10⁴/mL，培养2-4天后将细胞悬液移出，离心去除原培养基，更换新的Stem Pro34无血清培养基，并置于新的不含滋养层细胞的培养瓶中继续培养1-2天。

10.如权利要求9所述的将外周血免疫γδT细胞诱导成多能干细胞的方法，其特征在于，步骤5)的具体操作过程为：先移去一半的Stem Pro34无血清培养基，换为胚胎干细胞培养基，培养1-2天，将所有培养基替换为胚胎干细胞培养基，继续培养。