[发明专利]基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法

说明书

本发明公开了一种基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针，所述核酸适配体可特异性识别黄曲霉毒素B1，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，所述探针与上述核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示。本发明所述黄曲霉毒素B1免标记均相检测方法，步骤如下：(1)制备探针‑核酸适配体杂交反应液；(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线；(3)实际物质所含黄曲霉毒素B1的检测。使用本发明所述方法，不需对所述核酸适配体及探针进行标记，在均相溶液环境进行荧光检测，就可得到测试样品中所含黄曲霉毒素B1的浓度，因而可简化操作，缩短检测时间，降低检测成本。

技术领域

本发明属于黄曲霉毒素B1检测领域，涉及一种与可特异性识别黄曲霉毒素B1的核酸适配体双端互补的探针及利用聚集诱导发光技术(AIE)和所述核酸适配体、与核酸适配体双端互补的探针均相免标记检测黄曲霉毒素B1的方法。

背景技术

黄曲霉菌是广泛分布于自然界的腐生真菌，可以寄生于粮食、食品及饲料中进行生长繁殖，并在此过程中产生真菌毒素——黄曲霉毒素(Aflatoxin)。黄曲霉毒素(Aflatoxin)是化学结构相似的一类衍生物，是黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的一种次级代谢产物。该毒素容易污染粮食作物及其制品，是目前已发现的最强的天然致癌物质，其中，黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，简称AFB1)是一种毒性最强的黄曲霉毒素，被国际癌症研究机构确认为一种最主要的致癌物。因此，黄曲霉毒素B1的快速、廉价、不依赖大型仪器的检测方法非常需要。

我国针对黄曲霉毒素B1的国家标准检测方法有五种，即同位素稀释液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-柱前衍生法、高效液相色谱-柱后衍生法、薄层色谱法和酶联免疫吸附筛查法。上述方法由于仪器设备昂贵或/和操作步骤复杂繁琐、耗时长，检测环境条件要求高，或抗体较为昂贵，并且不易保存等因素，不便于在企业实际生产中应用和推广。

核酸适配体(aptamer)是一段能够与靶分子高亲和力、高特异性结合的单链寡核苷酸，已用于黄曲霉毒素B1的检测，目前已公开的利用核酸适配体检测黄曲霉毒素B1的方法需在核苷酸序列上进行标记，或结合其它纳米材料，因而检测成本仍然较为昂贵，并且不能实现在同一试管内均相检测黄曲霉毒素B1。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，以简化分析步骤，降低分析成本。

本发明中的核酸适配体可特异性识别黄曲霉毒素B1，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示，简称“AFB1核酸适配体”，本发明中的探针与AFB1核酸适配体双端互补，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示，命名为“Block探针”。

本发明所述黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，步骤如下：

(1)制备探针-核酸适配体杂交反应液

将Block探针、AFB1核酸适配体溶解在核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease Ibuffer中并混合均匀形成反应体系，然后在80～90℃保温3～5min退火，再置于室温杂交反应30～40min即形成探针-核酸适配体杂交反应液；反应体系中，Block探针与AFB1核酸适配体的摩尔比为1:1，核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease I buffer的量以能完全溶解所加入的Block探针和AFB1核酸适配体计量；

(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线