[发明专利]基于聚集发光的双端互补核酸适配体探针及黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法

权利要求书

1.一种基于聚集发光的黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤如下：

(1)制备探针-核酸适配体杂交反应液

用可特异性识别黄曲霉毒素B1且核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1的核酸适配体和与该核酸适配体双端互补、核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2的探针制备探针-核酸适配体杂交反应液，将所述探针和所述核酸适配体溶解在核酸外切酶缓冲溶液1×ExonucleaseI buffer中并混合均匀形成反应体系，然后在80～90℃保温3～5min退火，再置于室温杂交反应30～40min即形成探针-核酸适配体杂交反应液，探针-核酸适配体杂交反应液中，所述探针和所述核酸适配体通过杂交反应结合形成两端互补的稳定结构；反应体系中，所述探针与所述核酸适配体的摩尔比为1:1，核酸外切酶缓冲溶液1×Exonuclease I buffer的量以能完全溶解所加入的所述探针和所述核酸适配体计量；

(2)建立黄曲霉毒素B1浓度与荧光强度的标准曲线

配制一系列不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液，然后将一定量不同浓度黄曲霉毒素B1标准品水溶液分别与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，染料DSAI吸附聚集所述探针和所述核酸适配体通过杂交反应结合形成的两端互补的稳定结构产生较强的荧光信号，染料DSAI吸附聚集离解的探针被切割成的碎片产生较弱的荧光信号，继后进行荧光检测，并根据荧光检测结果建立以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标的标准曲线；

(3)实际物质所含黄曲霉毒素B1的检测

将待测实际物质进行处理得到测试样品，将一定量测试样品与一定量步骤(1)制备的探针-核酸适配体杂交反应液混合均匀，于室温静置30～60min，进行黄曲霉毒素B1识别，使杂交反应后的所述探针和核酸适配体离解，再分别加入核酸外切酶Exonuclease I并混合均匀在37℃静置30～60min对离解的探针进行切割，使其碎片化，再分别加入具有聚合诱导发光特性的染料DSAI并混合均匀，继后进行荧光检测得到荧光强度，将所得荧光强度带入步骤(2)所建立标准曲线的方程，即可计算出实际物质所含黄曲霉毒素B1的浓度。

2.根据权利要求1所述基于聚集发光的黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤(3)中，将待测实际物质进行处理得到测试样品的操作如下：

在室温下将待测实际物质加入提取液中震荡40～60min，震荡完成后离心8～10min，转速为5000～6000rpm，然后取上清液作为测试样品；所述提取液由甲醇和超纯水组成，甲醇与超纯水的体积比为7:3，待测实际物质与提取液的体积比为1:(3～5)，或待测实际物质与提取液的质量与体积之比为1:(3～5)，所述质量的单位为g，所述体积的单位为mL。

3.根据权利要求1或2所述基于聚集发光的黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤(2)中，黄曲霉毒素B1标准品水溶液与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比为1:8，核酸外切酶Exonuclease I与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比为1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与黄曲霉毒素B1标准品水溶液的体积比为1:2；

步骤(3)中，测试样品与探针-核酸适配体杂交反应液的体积比为1:8，核酸外切酶Exonuclease I与测试样品的体积比为1:2，染料DSAI的浓度为100μM，浓度100μM的染料DSAI与测试样品的体积比为1:2。

4.根据权利要求1或2所述基于聚集发光的黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，荧光检测的激发波长均为405nm，发射波长均为425～700nm。

5.根据权利要求3所述基于聚集发光的黄曲霉毒素B1均相免标记检测方法，其特征在于步骤(2)和步骤(3)中，荧光检测的激发波长均为405nm，发射波长均为425～700nm。