[发明专利]一种多重RT-PCR检测试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种多重RT‑PCR检测试剂盒及其在同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2中的应用。试剂盒含质控病毒MS2和三种质控模板(含NoV GI、NoV GII和MS2特异性核苷酸序列的质粒)。检测体系含诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2各自的正向引物、反向引物和特异性探针。本发明的多重检测体系及其试剂盒与传统方法相比不需要采用常规单一检测，可在同一反应体系内直接对检测样品中混合病毒进行同步检测和分析，检测信号干扰性小，灵敏度高，第一时间为医院食源性疾病监测及食品样品提供全面、精确、高效的诺如病毒检测结果及参考。

(一)技术领域

本发明涉及一种多重PCR检测试剂盒，特别涉及一种同时检测诺如病毒GI、GII型和大肠杆菌噬菌体MS2的多重PCR检测试剂盒及方法。

(二)背景技术

诺如病毒(Norovirus,NoV)属于杯状病毒科(Caliciviruses)的诺瓦克病毒属。1972年由Kapikian等学者首次用电镜的方法发现。该病毒基因组分子大小为7.3-7.6Kb，通常根据NV病毒RNA聚合酶编码区核苷酸或外壳蛋白区氨基酸序列的差异，可将NV分为5个不同的基因型(GGI、GGII、GGIII、GGIV和GGV)，其中GGI和GGII为常见的致病型。诺如病毒对外界的抵抗力较强，通常能引起自限性、轻中度的胃肠道感染症，其特点是高发病率、低致病剂量。诺如病毒目前被认为是世界范围内流行性、非细菌胃肠炎暴发的主要原因。

大肠杆菌噬菌体MS2属于非细胞原生物的细菌病毒，专性感染和寄生于相应的活细菌体内，具有作为水体中肠道病毒指示物的基本条件；对人没有致病性，且在有肠道病毒污染的水环境中普遍存在；可实验室培养，数量高于肠道病毒，在形态特征、理化特性、对自然环境条件和消毒剂的抗性等方面与肠道病毒类似；检测操作具有简便快速、安全可靠、受环境影响小和设备简单等优点。基于以上几点考虑，在目前的病毒检测中通常加入MS2作为食品以及水体中病毒样本的提取及PCR检测的质量控制标品。

近年来，随着当前国际贸易、国际旅游业的快速增长，食品市场的全球化引发了食品的高风险性，并使食源性疾病有在全球蔓延的趋势。全球食源性疾病和恶性食品污染事件频频的发生，使食品安全已成为一个严重并不断扩大的世界卫生问题，并日益成为全球关注的热点。作为食品安全的头号问题，食源性疾病的发生中多数是由诺如病毒引起的。2006年11月，日本、新加坡、意大利等地相继发生了与食品有关的诺如病毒集体感染事件，特别是日本，不到两个月累计发生了35.76万人感染了诺如病毒。中国自1995年报告首例诺如病毒感染病例后，国内许多地区多次暴发诺如病毒感染性急性胃肠炎(疫情主要集中在广东和浙江省)。诺如病毒已日益成为重要的公共卫生问题。

长期以来，由于病毒检测技术落后，且病毒个体较小(直径约为50-300nm)，难于直接检测等原因，阻碍了病毒检测的发展。近年来，随着分子生物学技术的进步，常规核酸PCR和半数组织细胞感染量(TCID50)成为了病毒的主要方法。随着新技术的发展，相对于常规核酸PCR而言，新出现的多重荧光定量PCR技术使得病毒的整个检测过程具有了实时检测、定量准确、高效、高灵敏度和重复性好等优点。目前，由于诺如病毒还不能够完全在实验室条件下进行培养，荧光定量PCR技术已成为诺如病毒的主要检测方法。发达国家应用该技术对诺如病毒检测研究已从单纯的检测诺如病毒GI/GII型到同时检测两种或者三种不同类型的病毒。而我国对诺如病毒检测技术研究起步较晚，多重荧光定量PCR技术的引入，将进一步增强诺如病毒检测的范围、高效性和灵敏度。

综上所述，尽管目前国际上关于不同诺如病毒检测的方法已有不少报道，但由于病毒往往附着在食品、水以及其他物品的表面或者内部，在具体操作过程中往往需要加入质控样品MS2，才能保证每次操作的准确性和重复性。因此，我们针对混合病毒样本(目的病毒和质控病毒)中的核酸扩增进行了优化，提高了检测效率和准确性，对控制诺如病毒感染，保障人民生命健康具有重要的理论和实践意义。

(三)发明内容