[发明专利]一种多重RT-PCR检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

(1)RNA提取试剂，以大肠杆菌噬菌体MS2为RNA提取质控；

(2)PCR反应体系：含诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2各自的正向引物、反向引物和特异性探针；

诺如病毒GI型引物、特异性探针：

正向引物GI-F：5’-GGCAGATGATGAGCGTGAGG-3’

反向引物GI-R：5’-AGAAACCCCATCCAGACCCAAACT-3’

特异性探针Probe-P:5’-HEX-CACTTTATGGAGCAGAGTGAC-BHQ-3’；

诺如病毒GII型引物、特异性探针：

正向引物GII-F：5’-CTAGAAACGCTCCAGGTGAAAT-3’

反向引物GII-R：5’-TCTGGCCAAATGGGAAAGGTAA-3’

特异性探针Probe-P:5’-FAM-CCCTTGGGCCCTGATTTGA-TAMRAR-3’；

大肠杆菌噬菌体MS2引物、特异性探针：

正向引物MS-F：5’-ATTCCGACTGCGAGCTTATTGTT-3’

反向引物MS-R：5’-GGAGTTTGCTGCGATTGCTGAGG-3’

特异性探针Probe-P:5’-ROX-AATCGGGTTTCCATCTTTTAG-BHQ2-3’；

(3)PCR质控反应体系：以含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GI、含SEQID NO.11所示核苷酸序列的质粒pcDA-NoV-GII及含SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的质粒pcDA-MS2的混合质粒作为PCR质控反应模板；

SEQ ID NO.10所示核苷酸序列：

5’-ggcagatgatgagcgtgaggtggattacaatgagaagatcagttttgaggcgccccccactttatggagcagagtgacaaagtttgggtctggatggggtttct-3’；

SEQ ID NO.11所示核苷酸序列：

5’-ctagaaacgctccaggtgaaatactatggagcgcgcccttgggccctgatttgaatccttacctttcccatttggccaga-3’；

SEQ ID NO.12所示核苷酸序列：

5’-attccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactcc-3’。

2.如权利要求1所述的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应体系还包括反应缓冲液，逆转录酶，DNA聚合酶和DEPC水。

3.如权利要求1所述的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于PCR反应体系为2×buffer12.5μL，逆转录酶和DNA聚合酶各0.5μL，20μmol/L正向引物0.3μL，20μmol/L反向引物0.3μL，20μmol/L特异性探针0.15μL，模板5μL，DEPC水补齐至25μL。

4.一种权利要求1所述多重RT-PCR检测试剂盒在制备同时检测诺如病毒GI型、诺如病毒GII型和大肠杆菌噬菌体MS2药物中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法如下：

(1)RNA提取：向待测样本中加入大肠杆菌噬菌体MS2，提取混合病毒RNA；所述大肠杆菌噬菌体MS2加入量为1.3×10⁵PFU/mL；

(2)PCR扩增反应：以步骤(1)混合病毒RNA为模板，加入反应缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶和DEPC水构成PCR反应体系，进行PCR扩增；PCR扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，58-64℃退火、延伸35s，39个循环，退火温度处同时收集荧光信号；同样条件下，以混合质粒作为PCR质控反应模板进行PCR扩增，以校准混合病毒RNA的扩增效率；

(3)步骤(2)中HEX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GI型；若FAM荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有诺如病毒GII型；若ROX荧光信号对应的Ct值小于等于30，则样品中含有大肠杆菌噬菌体MS2。