[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法

说明书

本发明的目的是提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法。首先从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组乳铁蛋白的粗提取物，提取缓冲液包含50～100mM柠檬酸‑柠檬酸三钠、100～200mMNaCl，1～10mM EDTA‑2Na，pH为3.8～5.0；再将所得含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析，获得纯度＞95％的低铁饱和度乳铁蛋白产品。本发明的另一目的是提供一种从基因工程水稻中种子中提取低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法，使用的提取液含有柠檬酸‑柠檬酸三钠和EDTA‑2Na，可显著降低提取OsrhLF的铁饱和度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法。

背景技术

乳铁蛋白(LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白，广泛存在于哺乳动物的外分泌液中，是人体防止感染的第一道防线，具有广谱抗菌作用，可以作用于细菌、真菌、原生动物、病毒。乳铁蛋白主要有“铁剥夺”、膜渗透、酶抑制及辅助抗菌等4种抑菌机制。(1)铁剥夺机制。几乎所有的细菌生长都需要铁，铁离子对细菌中的氧化酶是必须的。乳铁蛋白作为一种铁结合蛋白，可以与微生物竞争性的结合铁离子，从而使得微生物失去赖以生存的铁离子，进而导致微生物的死亡。这种依赖于铁的抑菌机制中，乳铁蛋白的活性取决于铁离子的饱和程度。一般来说，饱和度越低，抑菌活性越高。(2)膜渗透机制。乳铁蛋白带正电荷，与带负电荷的磷脂、核酸和脂多糖具有很强的亲和性，从而导致脂多糖的释放，进而破坏细菌的细胞质膜。(3)酶抑制机制。研究表明，乳铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶有强烈的抑制作用，而半胱氨酸蛋白酶抑制剂可有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。(4)辅助抗菌机制。乳铁蛋白可以通过改变细菌与寄主之间的关系.从而间接达到抗菌作用。

铁饱和度是乳铁蛋白制品的一项关键性指标，围绕低铁饱和度的乳铁蛋白的提取和制备有许多相关研究。专利CN102459328A公开了一种制备低铁饱和度的乳铁蛋白的方法，该方法包括使用水混溶性溶剂和酸剥夺乳铁蛋白的中的铁，然后利用超滤或渗滤去除铁、溶剂和酸，得到的乳铁蛋白的铁饱和度小于10％。其他一些关于降低乳铁蛋白的铁饱和度的研究结果涉及使用螯合剂和低pH环境来去除乳铁蛋白中的铁，但是得到的乳铁蛋白铁饱和度通常大于10％且不适宜商业化生产。

在专利《一种从水稻种子中分离纯化重组人乳铁蛋白的方法》(专利号:CN104109204B)中，我们介绍了一种从基因工程水稻中分离纯化乳铁蛋白的方法，但是该方法获得乳铁蛋白的铁饱和度70％～80％，远高于正常母乳或牛乳中15％～20％的铁饱和度。本发明是在上述专利的基础上，针对铁饱和度低的重组乳铁蛋白的制备方法，通过对提取工艺及层析工艺研究，建立一种大规模、高效、工艺简单地获得低铁饱和度乳铁蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白(OsrhLF)的方法。

包括以下步骤：

1)从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的粗提取物，提取缓冲液中含有50～100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100～200mMNaCl，1～10mM EDTA-2Na，pH为3.5～5.0；

2)将含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析介质，获得纯度＞95％的低饱和度乳铁蛋白产品；

进一步的上述方法包含以下步骤：

(1)将基因工程稻谷脱壳成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1:5(重量/体积，kg/L)的比例混合，于15～35℃提取1～24小时。提取缓冲液的成分为：50～100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100～200mMNaCl，10mM EDTA-2Na，pH 3.8～5.0。将上述得到的混合物加入2～5％的珍珠岩进行压滤，压滤完毕后，滤液用0.5～2M NaOH或稀盐酸调pH至4.0～5.0，0.22μm滤膜过滤后即为OsrhLF的粗提取物即阳离子层析的上样液。