[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法

权利要求书

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法，依次包含以下步骤：

1) 从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的粗提取物，提取缓冲液包含50~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl，1~10mM EDTA-2Na，pH为3.5~5.0；

2) 将步骤1）所得含有重组人乳铁蛋白的粗提取物经阳离子层析，获得纯度＞95%的低铁饱和度人乳铁蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤 1) 所述重组人乳铁蛋白粗提取物提取方法包括步骤：

i ) 将含有重组人乳铁蛋白的基因工程稻米粉碎后与提取缓冲液按重量/体积比kg /L=1:5混合，在15～35℃下提取1~24小时；

ii ) 将步骤i )的提取混合物过滤后调节pH至4.0~5.0，获得阳离子层析的上样液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，所述提取液pH为3.8~5.0。

4.根据权利要求1或2所述的方法，从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的温度为20~30℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，从重组人乳铁蛋白基因工程水稻种子中提取含有重组人乳铁蛋白的时间为5~24h。

6.根据权利要求1或2所述的方法，步骤2）中阳离子层析上样液的pH为5.0。

7.根据权利要求1所述的方法，阳离子层析介质选择使用SP Bestarose Big Beads填料。

8.根据权利要求1或7所述的方法，所述步骤2）的层析方法为：

a）采用4~6倍柱体积的pH为4.0~5.0的含有50~150mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl，1~10mM EDTA-2Na的缓冲液以200~300cm/h的线性流速平衡层析柱；

b）以步骤1）的粗提物为层析上样液，其中上样液pH为4.0~5.0、电导20~30mS/cm，上样体积为20~40倍柱体积；

c）用pH为7.0~8.0的5~50mM PB，300-500mMNaCl缓冲液，以200~300cm/h的线性流速进行洗脱杂蛋白，洗杂液体积为5~7倍柱体积；

d）用pH为7.0~8.0的5~50mM PB，700~900 mMNaCl缓冲液，以200~300cm/h的线性流速进行洗脱重组人乳铁蛋白，收集含有OsrhLF的洗脱液。

9.根据权利要求8所述的方法，层析上样液的上样量不超过30倍柱体积。

10.一种从基因工程水稻种子中提取低铁饱和度的重组人乳铁蛋白的方法，包括以下步骤：

（1）将基因工程稻谷脱壳成半精米，研磨成80~100目的米粉；

（2）将米粉与提取缓冲液以重量/体积kg/L 为1:5的比例混合，于15~35℃提取1~24小时，提取缓冲液的成分为250~100mM柠檬酸-柠檬酸三钠、100~200mMNaCl，1~10mM EDTA-2Na，pH为3.8~5.0；

（3）将上述步骤（2）得到的混合物加入2~5%的珍珠岩进行压滤，得到含有重组人乳铁蛋白的提取液。