[发明专利]一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法

权利要求书

1.一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，其特征在于，试验材料包括80只SD大鼠、生理盐水、三种剂量的二妙散水煎剂、甲氨蝶呤，试验方法包括如下步骤：

S1：试验动物的处理

选择80只SD大鼠，将所有CIA模型大鼠随机分为6组，每组12-15只；灌胃生理盐水，为正常对照组和模型对照组，灌胃三种剂量的二妙散水煎剂，灌胃甲氨蝶呤2.7mg/(kg·周)，为阳性对照组，每次灌胃1mL/100g，连续灌胃15天，禁食，麻醉，杀检，腹主动脉取血，同时将脾脏、关节取材备用；

S2：建立CIA大鼠模型；

S3：脾脏系数指标检测

按照编号将大鼠体重与脾脏称重记录，通过计算公式脾脏系数＝脾脏重/体重得出结果，应用SPSS 20.0软件分析结果；

S4：血清中IL-6和TNF-α水平检测

检测血流变、血细胞检测及血浆中肿瘤坏死因子、白介素6水平的变化，依照试剂盒操作程序进行检测；

S5：关节滑膜切片病理检测观察

大鼠关节取材，EDTA脱钙，脱钙完成后纵向剖开踝关节，石蜡包埋，切片，HE染色，观测各组炎症的变化；

S6：吞噬细胞中IL-6、IL-37、TNF-α、CHRNA7 mRNA的表达检测水平检测；

提取大鼠成纤维样滑膜细胞总RNA，测定总RNA浓度，在PCR仪中反转录为cDNA，以cDNA为模板，在RT-PCR仪中与α7nAChR引物进行扩增，得到CT值，以GAPDH作参照，二妙散含药组成分组与空白组之间进行比较，得到2^-ΔΔCT即为关节滑膜腔中α7nAChR的mRNA变化；

S7：数据分析

通过SPSS 20.0软件分析，数据以均值xs表示，组间比较采用ANOVA分析和LSD-t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2.根据权利要求1所述的一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，其特征在于，步骤S1中的SD大鼠的体重为180±15g。

3.根据权利要求1所述的一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，其特征在于，步骤S1中二妙散水煎剂由黄柏与苍术1∶1制备。

4.根据权利要求1所述的一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，其特征在于，步骤S1中二妙散水煎剂0.12g/kg、0.24g/kg、0.36g/kg为小中大剂量组。

5.根据权利要求1所述的一种二妙散对类风湿关节炎抑炎因子表达试验方法，其特征在于，步骤S2包括如下步骤：

S2-1：初次免疫

通过牛二型胶原与弗氏完全佐剂乳化后浓度为1mg/mL，注射SD大鼠背部三点、尾跟部及任意一后足掌注射共0.5mL，正常组注射等量的生理盐水；

S2-2：加强免疫

2周后，给予实验组腹腔皮内注射含有牛二胶原1mg/mL的免疫复合物乳化液0.2mL/鼠，方法同上正常组皮内注射等量生理盐水；

S2-3：成模检验

根据传统关节评分指标对实验SD大鼠进行筛选。