[发明专利]群体感应抑制剂筛选方法和应用

说明书

本发明涉及一种群体感应抑制剂的筛选方法和应用，该方法系电泳中介微分析技术，在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外210nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法；该方法不仅具有快速简便、试剂消耗少、易于自动化、准确性高的优点，而且适用于群体感应抑制剂的筛选和分析，尤其适用于如中药粗提液等混合化合物样品中群体感应抑制剂的筛选，为以干扰群体感应系统作为新靶点的食品防腐保鲜策略提供理论依据。

技术领域

本发明属于酶抑制剂筛选方法，特别涉及的是群体感应抑制剂的筛选方法和应用，可以用于中药粗提物和合成小分子化合物的高通量筛选等方面。

背景技术

食品腐败是一个复杂的过程，其中微生物作用是引起食品腐败变质的主要因素之一。微生物通过分解蛋白质、脂质及糖类等营养物质进行生长繁殖，进而导致食品腐败，从而导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题（Gram L., Ravn L., Rasch M. J. FoodMicrobio., 2002, 78: 79-97）。群体感应(quorum sensing，QS)是细菌根据自身细菌浓度变化进行自我协调的一种群体行为，即细菌在生长繁殖过程中通过合成、分泌自诱导物作为信号分子，检测细菌浓度；当自诱导物浓度随着细菌群体密度达到一定阈值时，细菌便开启细胞密度依赖的特定基因表达机制（Bassler B.L., Greenberg E.P., Stevens A.M.J. bacteriology, 1997, 179: 4043-4045）。现有研究表明QS通过调控与食品腐败相关的蛋白质、脂肪、果胶、壳多糖等分解酶的活性导致食品腐败，研究人员已在不同的腐败食品中检测出了不同类型的QS信号分子（张彩丽，朱素琴，汪映，孙秀娇，曾名湧。生物技术通报，2014，150-155）。基于此，近年来信号分子介导的QS现象如何影响食品的品质以及与食品腐败的关系成为食品防腐保鲜领域的一个新的研究热点。但与QS在医疗、制药和生物防御等方面取得的显著进展相比，其在食品科学研究领域中仍然处于起步阶段。

任何能够阻止QS信号分子集聚或受体识别信号分子的过程都可阻断细菌QS依赖的毒力基因表达。因此，基于QS抑制剂的QS感应系统干扰的研究对于新型防腐技术的研究与开发具有重要意义。目前，常用的QS抑制剂筛选方法有指示菌株法、生物传感器法、计算机辅助设计法和动物模型法[21]。指示菌株法和生物传感器法的筛选结果假阳性较高，动物模型法需要较为繁琐的实验步骤和较高的成本，而计算机辅助设计法属于虚拟筛选，结果需要进一步验证。电泳中介微分析（EMMA）是在流动注射分析（FIA）和毛细管电泳（CE）基础上诞生的一项新的分析技术，被广泛应用于天然产物中酶激动剂、抑制剂的筛选研究。Hamdan等(I. I. Hamdan, F. U. Afifi. Saudi Pharmaceutical Journal, 2010, 18:91-95.)建立的天然植物提取物中α-淀粉酶抑制剂的EMMA筛选方法，首次从Geraniumrobertianum和Aesculus hippocastanii中发现了α-淀粉酶抑制剂。Nehmé课题组(R. Nehmé, H. Nehmé, G. Roux, et al. Journal of Chromatography A, 2013, 1318: 257-264.)以激酶CDK5为靶点，建立天然产物黄酮及其衍生产物的CE抗肿瘤活性筛选方法。赵书林课题组先后建立了天然产物中α-葡萄糖苷酶(A. Z. Zhang, F. G. Ye, J. Y. Lu, S.L. Zhao. Food Chemistry, 2013, 141: 1854-1859.)、腺苷脱氨酶(X. W. Ji, F. G.Ye, P. T. Lin, S. L. Zhao. Talanta, 2010, 82: 1170-1174.)、单胺氧化酶(K. Hu,L. C. Zhang, X. T. Li, S. L. Zhao. Journal of Chromatography B, 2010, 878:3156-3160.)抑制剂的CE筛选方法，利用CE超强的的分离能力，对天然产物的粗提物进行筛选。最近，康经武课题组(T. D. Wang, Q. Q. Zhang, Y. M. Zhang, J. W. Kang.Journal of Chromatography A, 2014, 1337: 188-193.)报道了天然产物中蛋白激酶抑制剂的CE筛选方法。从文献报道来看，目前，尚无采用毛细管电泳技术进行群体感应酶活性测定和抑制剂筛选的报道。因此，建立群体感应抑制剂毛细管电泳筛选方法，将为明确群体感应在食品腐败中的机制，构建以干扰群体感应系统作为新靶点的食品防腐保鲜策略提供理论依据。